尽管从理论上讲，模板的一个分子就足够了，但经典 PCR 通常使用相当大量的 DNA，例如，最多 1 µg 哺乳动物基因组 DNA 和少至 1 pg 质粒 DNA。最佳量很大程度上取决于目标序列的拷贝数及其复杂性。
如果使用很少的模板，则需要相应增加扩增循环次数才能获得足够量的产物。用于大多数 PCR 实验的 Taq 聚合酶不具有校正功能（3'-5' 核酸外切酶活性）；因此，扩增期间发生的错误无法被纠正。循环次数越多，缺陷产物的扩增就越普遍。另一方面，如果模板量太高，引物与其他（不是百分百互补）序列退火以及形成引物二聚体的概率将会增加，这将导致扩增副产品。在许多情况下，DNA 从细胞培养物或微生物中分离出来，随后用作 PCR 模板。纯化后，有必要确定 DNA 的浓度，以便能够确定 PCR 设置所需的体积。虽然琼脂糖凝胶电泳可以提供估计，但这种方法远不够准确。紫外-可见分光光度法已被确立为核酸定量的金标准；这种直接且简单快速的方法可测量样品在 260 nm 处的吸光度，并借助转换因子计算浓度。
然而，如果 DNA 浓度非常低（< 1 µg/mL dsDNA），或者被在 260 nm 范围内吸收的物质（例如 RNA、蛋白质、盐）污染，则该方法将达到其局限性。在浓度非常低的情况下，读数很快就会变得太不准确而无法使用，并且污染将导致（有时是巨大的）对实际值的高估。在这种情况下，使用荧光进行定量可能是一种替代方案。该技术基于使用特异性结合双链DNA的荧光染料，只有包含核酸和染料的复合物被光激发，并且随后它会发射稍高波长的光。这里，荧光信号的强度与 DNA 的量成正比，并且为了确定浓度，需要根据标准曲线对其进行评估。该方法的优点在于键的特异性，排除了污染引入的外部影响，以及由此产生的检测极低浓度 DNA 的能力。任一方法的适用性主要取决于样品浓度和纯度；在许多情况下，甚至建议并行应用这两种方法。
发布时间：2022年11月30日