Cryovialsthường được sử dụng để bảo quản đông lạnh các dòng tế bào và các vật liệu sinh học quan trọng khác, trong các lớp sương chứa đầy nitơ lỏng.

Có một số giai đoạn liên quan đến việc bảo quản thành công tế bào trong nitơ lỏng. Trong khi nguyên tắc cơ bản là đông lạnh chậm, kỹ thuật chính xác được sử dụng phụ thuộc vào loại tế bào và chất bảo quản lạnh được sử dụng. Có một số cân nhắc về an toàn và các phương pháp tốt nhất cần tính đến khi bảo quản tế bào ở nhiệt độ thấp như vậy.

Bài đăng này nhằm mục đích cung cấp một cái nhìn tổng quan về cách bảo quản cryovial trong nitơ lỏng.

Cryovial là gì

Cryovials là những lọ nhỏ có nắp được thiết kế để lưu trữ mẫu chất lỏng ở nhiệt độ cực thấp. Họ đảm bảo rằng các tế bào được bảo quản trong chất bảo vệ lạnh không tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng, giảm thiểu nguy cơ gãy tế bào trong khi vẫn được hưởng lợi từ hiệu ứng làm mát cực độ của nitơ lỏng.

Các lọ thường có sẵn với nhiều thể tích và kiểu dáng khác nhau - chúng có thể được ren bên trong hoặc bên ngoài với đáy phẳng hoặc tròn. Các định dạng vô trùng và không vô trùng cũng có sẵn.

Ai sử dụngCyrovialsđể lưu trữ tế bào trong nitơ lỏng

Một loạt NHS và các phòng thí nghiệm tư nhân cũng như các tổ chức nghiên cứu chuyên về ngân hàng máu cuống rốn, sinh học tế bào biểu mô, miễn dịch học và sinh học tế bào gốc sử dụng cryovials để bảo quản lạnh tế bào.

Các tế bào được bảo quản theo cách này bao gồm tế bào B và T, tế bào CHO, tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền thân, u lai, tế bào ruột, đại thực bào, tế bào gốc trung mô và tế bào tiền thân, bạch cầu đơn nhân, u tủy, tế bào NK và tế bào gốc đa năng.

Tổng quan về cách bảo quản cryovials trong nitơ lỏng

Bảo quản lạnh là một quá trình bảo quản tế bào và các cấu trúc sinh học khác bằng cách làm lạnh chúng ở nhiệt độ rất thấp. Tế bào có thể được lưu trữ trong nitơ lỏng trong nhiều năm mà không làm mất khả năng sống của tế bào. Đây là một phác thảo về các thủ tục được sử dụng.

Chuẩn bị tế bào

Phương pháp chính xác để chuẩn bị mẫu sẽ khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào, nhưng nói chung, các tế bào được thu thập và ly tâm để tạo thành một viên giàu tế bào. Viên này sau đó được treo lại trong phần nổi phía trên trộn với chất bảo quản lạnh hoặc môi trường bảo quản lạnh.

Môi trường bảo quản lạnh

Môi trường này được sử dụng để bảo quản tế bào trong môi trường nhiệt độ thấp mà chúng sẽ phải chịu bằng cách ức chế sự hình thành các tinh thể trong và ngoài tế bào và do đó làm chết tế bào. Vai trò của chúng là cung cấp môi trường bảo vệ, an toàn cho tế bào và mô trong quá trình đông lạnh, bảo quản và rã đông.

Một môi trường như huyết tương tươi đông lạnh (FFP), dung dịch plasmalyte heparin hóa hoặc dung dịch không có thành phần động vật, không có huyết thanh được trộn với các chất bảo vệ lạnh như dimethyl sulphoxide (DMSO) hoặc glycerol.

Các viên mẫu đã được hóa lỏng lại được chia thành các loại vật liệu làm lạnh bằng polypropylen nhưCông ty y sinh Tô Châu Ace Lọ lưu trữ đông lạnh.

Điều quan trọng là không đổ quá đầy các ống bảo quản vì điều này sẽ làm tăng nguy cơ nứt vỡ và có thể làm rò rỉ chất bên trong (1).

Tỷ lệ đóng băng được kiểm soát

Nói chung, tốc độ đông lạnh được kiểm soát chậm được sử dụng để bảo quản lạnh tế bào thành công.

Sau khi mẫu được chia thành các lọ đông lạnh, chúng được đặt trên đá ướt hoặc trong tủ lạnh 4oC và quy trình đông lạnh được bắt đầu trong vòng 5 phút. Theo hướng dẫn chung, tế bào được làm mát ở tốc độ -1 đến -3 mỗi phút (2). Điều này đạt được bằng cách sử dụng bộ làm mát có thể lập trình hoặc bằng cách đặt lọ vào hộp cách nhiệt đặt trong tủ đông có tốc độ được kiểm soát từ –70°C đến –90°C.

Chuyển sang Nitơ lỏng

Các lọ đông lạnh sau đó được chuyển sang bể chứa nitơ lỏng trong thời gian không xác định với điều kiện duy trì nhiệt độ dưới -135oC.

Những nhiệt độ cực thấp này có thể thu được bằng cách ngâm trong nitơ pha lỏng hoặc pha hơi.

Pha lỏng hay pha hơi?

Việc bảo quản trong nitơ pha lỏng được biết là có thể duy trì nhiệt độ lạnh với độ ổn định tuyệt đối, nhưng thường không được khuyến khích vì những lý do sau:

• Nhu cầu về khối lượng lớn (độ sâu) nitơ lỏng là mối nguy hiểm tiềm tàng. Bỏng hoặc ngạt do điều này là một nguy cơ thực sự.
• Các trường hợp lây nhiễm chéo được ghi nhận bởi các tác nhân truyền nhiễm như aspergillus, viêm gan B và lây lan virus qua môi trường nitơ lỏng (2,3)
• Khả năng nitơ lỏng rò rỉ vào lọ trong quá trình ngâm. Khi lấy ra khỏi nơi bảo quản và làm ấm đến nhiệt độ phòng, nitơ sẽ nở ra nhanh chóng. Do đó, lọ có thể vỡ khi lấy ra khỏi nơi lưu trữ nitơ lỏng, tạo ra mối nguy hiểm do các mảnh vụn bay ra và tiếp xúc với chất bên trong (1, 4).

Vì những lý do này, việc bảo quản ở nhiệt độ cực thấp phổ biến nhất là ở pha hơi nitơ. Khi mẫu phải được bảo quản ở pha lỏng thì nên sử dụng ống cryoflex chuyên dụng.

Nhược điểm của pha hơi là có thể xảy ra sự chênh lệch nhiệt độ theo chiều dọc dẫn đến dao động nhiệt độ trong khoảng -135oC đến -190oC. Điều này đòi hỏi phải theo dõi cẩn thận và siêng năng mức nitơ lỏng và sự thay đổi nhiệt độ (5).

Nhiều nhà sản xuất khuyến nghị rằng cryovials thích hợp để bảo quản ở nhiệt độ xuống tới -135oC hoặc chỉ sử dụng ở pha hơi.

Làm tan các tế bào được bảo quản lạnh của bạn

Quy trình rã đông rất căng thẳng đối với nuôi cấy đông lạnh và cần phải xử lý và kỹ thuật thích hợp để đảm bảo khả năng sống sót, phục hồi và chức năng tối ưu của tế bào. Các quy trình rã đông chính xác sẽ phụ thuộc vào loại tế bào cụ thể. Tuy nhiên, rã đông nhanh được coi là tiêu chuẩn để:

• Giảm bất kỳ tác động nào đến việc phục hồi tế bào
• Giúp giảm thời gian tiếp xúc với các chất hòa tan có trong môi trường đông lạnh
• Giảm thiểu mọi thiệt hại do kết tinh lại băng

Bể nước, bể hạt hoặc dụng cụ tự động chuyên dụng thường được sử dụng để làm tan mẫu.

Thông thường nhất, mỗi dòng tế bào được rã đông trong 1-2 phút, bằng cách lắc nhẹ trong bồn nước 37oC cho đến khi chỉ còn lại một chút đá trong lọ trước khi chúng được rửa trong môi trường tăng trưởng đã được làm ấm trước.

Đối với một số tế bào như phôi động vật có vú, việc làm ấm chậm là điều cần thiết cho sự sống sót của chúng.

Các tế bào hiện đã sẵn sàng để nuôi cấy tế bào, phân lập tế bào hoặc trong trường hợp tế bào gốc tạo máu - nghiên cứu khả năng sống sót để đảm bảo tính toàn vẹn của tế bào gốc của người hiến tặng trước khi điều trị sẹo lồi.

Thông thường, lấy một lượng nhỏ mẫu đã rửa trước để đếm tế bào nhằm xác định nồng độ tế bào cho môi trường nuôi cấy. Sau đó, bạn có thể đánh giá kết quả của quy trình phân lập tế bào và xác định khả năng sống của tế bào.

Thực hành tốt nhất để lưu trữ Cryovials

Việc bảo quản lạnh thành công các mẫu được bảo quản trong tủ lạnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong quy trình bao gồm lưu trữ và lưu giữ hồ sơ thích hợp.

• Tách ô giữa các vị trí lưu trữ– Nếu thể tích cho phép, hãy chia tế bào thành các lọ và bảo quản ở các vị trí riêng biệt để giảm nguy cơ mất mẫu do lỗi thiết bị.
• Ngăn ngừa lây nhiễm chéo– Lựa chọn lọ đông lạnh vô trùng hoặc nồi hấp tiệt trùng dùng một lần trước khi sử dụng tiếp theo
• Sử dụng lọ có kích thước phù hợp cho tế bào của bạn– lọ có nhiều thể tích từ 1 đến 5ml. Tránh đổ đầy lọ để giảm nguy cơ nứt.
• Chọn lọ đông lạnh có ren bên trong hoặc bên ngoài– Lọ có ren bên trong được một số trường đại học khuyến nghị sử dụng để đảm bảo an toàn - chúng cũng có thể ngăn ngừa ô nhiễm trong quá trình chiết rót hoặc khi bảo quản trong nitơ lỏng.
• Ngăn chặn rò rỉ- Sử dụng vòng đệm hai lớp được đúc vào nắp vặn hoặc vòng chữ O để tránh rò rỉ và nhiễm bẩn.
• Sử dụng mã vạch 2D và lọ nhãn– để đảm bảo khả năng truy xuất nguồn gốc, các lọ có vùng viết lớn cho phép mỗi lọ được dán nhãn đầy đủ. Mã vạch 2D có thể giúp quản lý lưu trữ và lưu trữ hồ sơ. Mũ có mã màu rất hữu ích để nhận dạng dễ dàng hơn.
• Bảo trì lưu trữ đầy đủ- Để đảm bảo tế bào không bị thất thoát, bình bảo quản phải liên tục theo dõi nhiệt độ và nồng độ nitơ lỏng. Cần trang bị hệ thống báo động để cảnh báo người dùng về lỗi.

Phòng ngừa an toàn

Nitơ lỏng đã trở thành phương pháp phổ biến trong nghiên cứu hiện đại nhưng có nguy cơ gây thương tích nghiêm trọng nếu sử dụng không đúng cách.

Nên đeo thiết bị bảo hộ cá nhân (PPE) phù hợp để giảm thiểu nguy cơ bị tê cóng, bỏng và các sự cố bất lợi khác khi xử lý nitơ lỏng. Mặc

• Găng tay đông lạnh
• Áo khoác phòng thí nghiệm
• Tấm chắn toàn mặt chống va đập và che cả cổ
• Giày bít mũi
• Tạp dề nhựa chống tia nước

Tủ lạnh nitơ lỏng nên được đặt ở những nơi thông gió tốt để giảm thiểu nguy cơ ngạt thở - nitơ thoát ra sẽ bay hơi và thay thế oxy trong khí quyển. Các cửa hàng có khối lượng lớn nên có hệ thống báo động lượng oxy thấp.

Làm việc theo cặp khi xử lý nitơ lỏng là lý tưởng và nên cấm sử dụng nó ngoài giờ làm việc bình thường.

Cryovials để hỗ trợ quy trình làm việc của bạn

Công ty Y sinh Ace Tô Châu cung cấp nhiều lựa chọn sản phẩm đáp ứng nhu cầu bảo quản lạnh của bạn cho các loại tế bào khác nhau. Danh mục sản phẩm bao gồm nhiều loại ống cũng như nhiều loại dụng cụ đông lạnh vô trùng.

Cryovials của chúng tôi là:

• Nắp vặn phòng thí nghiệm 0,5mL 1,5mL 2,0mL Lọ đông lạnh Cryovial Cryotube đáy hình nón có miếng đệm

  ● Thông số kỹ thuật 0,5ml, 1,5ml, 2,0ml, có váy hoặc không có váy
  ● Cả hai đều có sẵn thiết kế hình nón hoặc tự đứng, vô trùng hoặc không vô trùng
  ● Ống có nắp vặn được làm bằng polypropylen y tế
  ● Lọ PP Cryotube có thể được đông lạnh và rã đông nhiều lần
  ●Thiết kế nắp bên ngoài có thể làm giảm khả năng nhiễm bẩn trong quá trình xử lý mẫu.
  ● Ống đông lạnh có nắp vặn Ren vít đa năng để sử dụng
  ● Ống phù hợp với hầu hết các loại rôto phổ biến
  ● Ống vòng chữ O dạng ống đông lạnh phù hợp với các hộp cấp đông 1 inch và 2 inch, 48 giếng, 81 giếng, 96 giếng và 100 giếng tiêu chuẩn
  ● Có thể hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C và có thể đông lạnh ở nhiệt độ -86°C

  PHẦN KHÔNG	VẬT LIỆU	ÂM LƯỢNG	mũMÀU SẮC	chiếc/CÁI TÚI	TÚI/HỘP
  ACT05-BL-N	PP	0,5ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10