Việc tiêu chuẩn hóa các quy trình bao gồm tối ưu hóa chúng, thiết lập và hài hòa hóa sau đó, cho phép đạt được hiệu suất tối ưu lâu dài – không phụ thuộc vào người dùng. Tiêu chuẩn hóa đảm bảo kết quả chất lượng cao cũng như khả năng tái tạo và so sánh của chúng.
Mục tiêu của PCR (cổ điển) là tạo ra kết quả đáng tin cậy và có thể lặp lại. Đối với một số ứng dụng nhất định, hiệu suất củasản phẩm PCRcũng có liên quan. Đối với những phản ứng này, phải cẩn thận để đảm bảo rằng các mẫu không bị ảnh hưởng và quy trình PCR vẫn ổn định. Cụ thể, điều này có nghĩa là giảm thiểu sự lây nhiễm có thể dẫn đến kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả hoặc thậm chí ức chế phản ứng PCR. Hơn nữa, các điều kiện phản ứng phải càng giống nhau càng tốt đối với từng mẫu riêng lẻ trong một lần chạy và cũng có thể áp dụng được cho các phản ứng tiếp theo (của cùng một phương pháp). Điều này đề cập đến thành phần của phản ứng cũng như loại điều khiển nhiệt độ trong máy quay vòng. Tất nhiên, lỗi của người dùng là phải tránh càng nhiều càng tốt.
Dưới đây, chúng tôi sẽ trình bày những thách thức gặp phải trong quá trình chuẩn bị và trong suốt quá trình PCR - cũng như các phương pháp tiếp cận các giải pháp hiện có đối với các thiết bị và vật tư tiêu hao được sử dụng để tiêu chuẩn hóa quy trình PCR.
Chuẩn bị phản ứng
Việc phân phối các thành phần phản ứng vào các bình hoặc đĩa PCR tương ứng bao gồm nhiều thách thức cần phải vượt qua:
Điều kiện phản ứng
Việc định lượng chính xác và chính xác từng thành phần riêng lẻ là không thể thiếu khi hướng tới các điều kiện phản ứng giống hệt nhau nhất có thể. Ngoài kỹ thuật pipet tốt, việc lựa chọn công cụ phù hợp là rất quan trọng. Hỗn hợp PCR thường chứa các chất làm tăng độ nhớt hoặc tạo bọt. Trong quá trình sử dụng pipet, những điều này dẫn đến làm ướt đáng kể chấtmẹo pipet, do đó làm giảm độ chính xác của pipet. Việc sử dụng hệ thống phân phối trực tiếp hoặc đầu tip pipet thay thế ít bị ướt hơn có thể cải thiện độ chính xác và độ chính xác của quy trình pipet.
Ô nhiễm
Trong quá trình phân phối, các hạt khí dung được tạo ra, nếu được để lọt vào bên trong pipet, có thể làm ô nhiễm một mẫu khác trong bước hút mẫu tiếp theo. Điều này có thể được ngăn chặn bằng cách sử dụng các mẹo lọc hoặc hệ thống dịch chuyển trực tiếp.
Các vật dụng tiêu hao nhưlời khuyên, các bình và đĩa được sử dụng trong quy trình PCR không được chứa các chất làm ảnh hưởng đến mẫu hoặc làm sai lệch kết quả. Chúng bao gồm DNA, DNase, RNase và chất ức chế PCR, cũng như các thành phần có khả năng rò rỉ ra khỏi vật liệu trong quá trình phản ứng – những chất được gọi là chất ngâm chiết.
Lỗi người dùng
Càng xử lý nhiều mẫu thì nguy cơ lỗi càng cao. Có thể dễ dàng xảy ra trường hợp pipet mẫu vào nhầm bình hoặc sai giếng. Rủi ro này có thể được giảm thiểu đáng kể bằng cách đánh dấu giếng một cách dễ dàng. Thông qua việc tự động hóa các bước phân phối, “yếu tố con người”, tức là lỗi và các biến thể liên quan đến người dùng, được giảm thiểu, do đó tăng khả năng tái lập, đặc biệt trong trường hợp thể tích phản ứng nhỏ. Điều này đòi hỏi các tấm có đủ độ ổn định kích thước để được sử dụng trong trạm làm việc. Mã vạch đính kèm giúp máy dễ đọc hơn, giúp đơn giản hóa việc theo dõi mẫu trong toàn bộ quá trình.
Lập trình máy điều nhiệt
Việc lập trình một công cụ có thể tốn thời gian cũng như dễ xảy ra lỗi. Các tính năng khác nhau của máy quay vòng nhiệt PCR phối hợp với nhau để đơn giản hóa bước quy trình này và quan trọng nhất là đảm bảo an toàn:
Vận hành dễ dàng và hướng dẫn người dùng tốt là cơ sở của việc lập trình hiệu quả. Dựa trên nền tảng này, việc quản trị người dùng được bảo vệ bằng mật khẩu sẽ ngăn chặn các chương trình của chính mình bị người dùng khác thay đổi. Nếu sử dụng nhiều máy tuần hoàn (cùng loại), sẽ có lợi nếu chương trình có thể được truyền trực tiếp từ thiết bị này sang thiết bị khác thông qua USB hoặc kết nối. Phần mềm máy tính cho phép quản lý tập trung và an toàn các chương trình, quyền của người dùng và tài liệu trên máy tính.
Chạy PCR
Trong quá trình chạy, DNA được khuếch đại trong bình phản ứng, trong đó mỗi mẫu phải chịu các điều kiện phản ứng nhất quán, giống hệt nhau. Các khía cạnh sau đây có liên quan đến quá trình này:
Kiểm soát nhiệt độ
Độ chính xác tuyệt vời trong việc kiểm soát nhiệt độ và tính đồng nhất của khối chu trình là cơ sở để điều hòa nhiệt độ đồng đều cho tất cả các mẫu. Chất lượng cao của các bộ phận làm nóng và làm mát (các bộ phận peltier), cũng như cách chúng được kết nối với khối, là những yếu tố quyết định sẽ xác định nguy cơ chênh lệch nhiệt độ được gọi là “hiệu ứng cạnh”
Bay hơi
Nồng độ của các thành phần phản ứng riêng lẻ không được thay đổi trong quá trình phản ứng do bay hơi. Nếu không thì có thể có rất ítsản phẩm PCRcó thể được tạo ra hoặc không có gì cả. Do đó, điều quan trọng là giảm thiểu sự bay hơi bằng cách đảm bảo niêm phong an toàn. Trong trường hợp này, nắp gia nhiệt của máy điều nhiệt và vòng đệm của bình làm việc chặt chẽ với nhau. Các tùy chọn niêm phong khác nhau có sẵn choĐĩa PCR (link: Bài viết niêm phong), nhờ đó đạt được độ kín tốt nhất thông qua việc hàn nhiệt. Các cách đóng khác cũng có thể phù hợp, miễn là áp suất tiếp xúc của nắp máy tuần hoàn có thể được điều chỉnh theo vòng bịt đã chọn.
Quá trình tiêu chuẩn hóa được thực hiện để đảm bảo kết quả chính xác và có thể lặp lại trong thời gian dài. Điều này bao gồm việc bảo trì thường xuyên thiết bị để đảm bảo rằng thiết bị luôn ở trong tình trạng hoạt động tốt. Tất cả các vật tư tiêu hao phải có chất lượng cao nhất quán trong tất cả các lô được sản xuất và tính sẵn có đáng tin cậy của chúng phải được đảm bảo.
Thời gian đăng: 29-11-2022