Mặc dù về mặt lý thuyết, một phân tử của mẫu là đủ, nhưng lượng DNA lớn hơn đáng kể thường được sử dụng cho PCR cổ điển, ví dụ, lên tới 1 µg DNA bộ gen của động vật có vú và chỉ 1 pg DNA plasmid. Số lượng tối ưu phụ thuộc phần lớn vào số lượng bản sao của chuỗi mục tiêu cũng như độ phức tạp của nó.
Nếu sử dụng rất ít mẫu thì cần tăng số chu kỳ khuếch đại tương ứng để thu được đủ lượng sản phẩm. Taq polymerase được sử dụng cho hầu hết các thí nghiệm PCR không có chức năng hiệu chỉnh (hoạt động exonuclease 3′-5′); do đó, các lỗi xảy ra trong quá trình khuếch đại không thể sửa được. Số chu kỳ càng cao thì khả năng khuếch đại sản phẩm bị lỗi sẽ càng phổ biến. Mặt khác, nếu số lượng mẫu quá cao, xác suất mồi gắn với các trình tự khác (không miễn phí một trăm phần trăm), cũng như sự hình thành các dimer mồi, sẽ tăng lên, điều này sẽ dẫn đến sự khuếch đại của sản phẩm phụ. Trong nhiều trường hợp, DNA được phân lập từ nuôi cấy tế bào hoặc từ vi sinh vật và sau đó được sử dụng làm mẫu PCR. Sau khi tinh sạch, cần xác định nồng độ DNA để có thể xác định thể tích cần thiết cho quá trình thiết lập PCR. Mặc dù điện di trên gel agarose có thể giúp đưa ra ước tính nhưng phương pháp này không chính xác. Phép đo quang phổ UV-Vis đã được coi là tiêu chuẩn vàng để định lượng axit nucleic; Phương pháp trực tiếp, do đó dễ dàng và nhanh chóng này đo độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm và nồng độ được tính toán với sự trợ giúp của hệ số chuyển đổi.
Tuy nhiên, nếu nồng độ DNA rất thấp (< 1 µg/mL dsDNA), hoặc nếu nó bị nhiễm các chất cũng hấp thụ trong phạm vi 260 nm (ví dụ RNA, protein, muối), thì phương pháp này sẽ gặp phải những hạn chế. Trong trường hợp nồng độ rất thấp, các kết quả đo sẽ sớm trở nên quá chính xác để sử dụng và sự nhiễm bẩn sẽ dẫn đến việc đánh giá quá cao (đôi khi rất lớn) giá trị thực tế. Trong trường hợp này, việc định lượng bằng huỳnh quang có thể là một giải pháp thay thế. Kỹ thuật này dựa trên việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết đặc biệt với DSDNA, chỉ phức hợp bao gồm axit nucleic và thuốc nhuộm bị kích thích bởi ánh sáng và sau đó nó sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng cao hơn một chút. Ở đây, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng DNA và để xác định nồng độ, nó được đánh giá dựa trên đường cong chuẩn. Ưu điểm của phương pháp này nằm ở tính đặc hiệu của liên kết, loại trừ các ảnh hưởng bên ngoài do ô nhiễm gây ra, cũng như khả năng phát hiện nồng độ DNA rất thấp. Sự phù hợp của một trong hai phương pháp phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ và độ tinh khiết của mẫu; trong nhiều trường hợp thậm chí có thể nên áp dụng song song cả hai phương pháp.
Thời gian đăng: 30/11/2022