Mặc dù về mặt lý thuyết, một phân tử của mẫu sẽ đủ, một lượng DNA lớn hơn đáng kể thường được sử dụng cho PCR cổ điển, ví dụ, lên tới 1 1 Số lượng tối ưu phụ thuộc phần lớn vào số lượng bản sao của chuỗi mục tiêu, cũng như vào độ phức tạp của nó.
Nếu rất ít mẫu được sử dụng, sẽ cần tăng số lượng chu kỳ khuếch đại để có được một lượng sản phẩm đủ. Một polymerase TAQ được sử dụng cho hầu hết các thí nghiệm PCR không có chức năng hiệu chỉnh (hoạt động exonuclease 3′-5); Do đó, các lỗi xảy ra trong quá trình khuếch đại không thể được sửa chữa. Số lượng chu kỳ càng cao, việc khuếch đại sản phẩm thiếu sót càng phổ biến. Mặt khác, nếu số lượng mẫu quá cao, thì khả năng các đoạn mồi được ủ thành các chuỗi khác (không một trăm phần trăm miễn phí), cũng như sự hình thành các bộ điều chỉnh mồi, sẽ tăng sản phẩm phụ. Trong nhiều trường hợp, DNA được phân lập từ nuôi cấy tế bào hoặc từ vi sinh vật và sau đó được sử dụng làm mẫu PCR. Sau khi tinh chế, cần xác định nồng độ DNA để có thể xác định khối lượng cần thiết cho thiết lập PCR. Trong khi điện di gel agarose có thể phục vụ để cung cấp một ước tính, phương pháp này không chính xác. Phổ UV-Vis đã được thiết lập như là tiêu chuẩn vàng để định lượng axit nucleic; Phương pháp trực tiếp và do đó dễ dàng và nhanh chóng đo lường độ hấp thụ của mẫu ở 260nm, và nồng độ được tính toán với sự trợ giúp của hệ số chuyển đổi.
Tuy nhiên, nếu nồng độ DNA rất thấp, (<1 Phag/mL DSDNA) hoặc nếu nó bị nhiễm các chất cũng hấp thụ trong phạm vi 260nm (ví dụ RNA, protein, muối), phương pháp này sẽ đạt đến hạn chế. Trong trường hợp nồng độ rất thấp, các bài đọc sẽ sớm trở nên quá không chính xác để được sử dụng và sự ô nhiễm sẽ dẫn đến việc đánh giá quá cao (đôi khi rất lớn) về giá trị thực tế. Trong trường hợp này, định lượng bằng cách sử dụng huỳnh quang có thể là một giải pháp thay thế. Kỹ thuật này dựa trên việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết cụ thể với DSDNA chỉ có phức hợp bao gồm axit nucleic và thuốc nhuộm bị kích thích bởi ánh sáng, và sau đó nó sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng cao hơn một chút. Ở đây, cường độ của tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng DNA và để xác định nồng độ, nó được đánh giá liên quan đến một đường cong tiêu chuẩn. Ưu điểm của phương pháp này dựa trên tính đặc hiệu của trái phiếu, loại trừ các ảnh hưởng bên ngoài được đưa ra bởi ô nhiễm, cũng như khả năng phát hiện nồng độ DNA rất thấp. Sự phù hợp của một trong hai phương pháp phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ và độ tinh khiết của mẫu; Trong nhiều trường hợp, thậm chí có thể nên áp dụng cả hai phương pháp song song.
Thời gian đăng: 30-2022