Nazariy jihatdan, shablonning bitta molekulasi etarli bo'lsa ham, klassik PCR uchun odatda ancha katta miqdordagi DNK ishlatiladi, masalan, 1 mkg gacha genomik sutemizuvchilar DNKsi va 1 pg plazmid DNKsi. Optimal miqdor ko'p jihatdan maqsadli ketma-ketlikning nusxalari soniga, shuningdek, uning murakkabligiga bog'liq.
Agar shablon juda kam ishlatilsa, etarli miqdordagi mahsulotni olish uchun kuchaytirish davrlari sonining mos keladigan ko'payishi kerak bo'ladi. Ko'pgina PCR tajribalari uchun ishlatiladigan Taq polimeraza tuzatish funktsiyasiga ega emas (3'-5' ekzonukleaza faolligi); shunday qilib, kuchaytirish vaqtida yuzaga kelgan xatolarni tuzatib bo'lmaydi. Tsikllar soni qanchalik ko'p bo'lsa, nuqsonli mahsulotning kuchayishi shunchalik keng tarqalgan bo'ladi. Agar boshqa tomondan, shablon miqdori juda yuqori bo'lsa, primerlarning boshqa (yuz foiz qo'shimcha emas) ketma-ketliklarga tavlanish ehtimoli, shuningdek, primer dimerlarining shakllanishi ortadi, bu esa amplifikatsiyaga olib keladi. yon mahsulotlar. Ko'p hollarda DNK hujayra madaniyatidan yoki mikroorganizmlardan ajratiladi va keyinchalik PCR shablon sifatida ishlatiladi. Tozalashdan so'ng, PCR o'rnatish uchun zarur bo'lgan hajmni aniqlash uchun DNK kontsentratsiyasini aniqlash kerak. Agaroz-gel elektroforezi taxminni ta'minlash uchun xizmat qilishi mumkin bo'lsa-da, bu usul aniqlikdan uzoqdir. UV-Vis spektrofotometriyasi nuklein kislotalarning miqdorini aniqlash uchun oltin standart sifatida o'rnatildi; bu to'g'ridan-to'g'ri va shuning uchun oson va tez usul 260 nm da namunaning absorbsiyasini o'lchaydi va konsentratsiya konvertatsiya koeffitsienti yordamida hisoblanadi.
Agar DNK kontsentratsiyasi juda past bo'lsa (< 1 µg/ml dsDNK) yoki u 260 nm diapazonda ham so'riydigan moddalar (masalan, RNK, oqsil, tuzlar) bilan ifloslangan bo'lsa, bu usul o'zining chegaralariga etadi. Juda past konsentratsiyalar bo'lsa, ko'rsatkichlar tez orada foydalanish uchun juda noto'g'ri bo'lib qoladi va ifloslanishlar haqiqiy qiymatni (ba'zan juda katta) ortiqcha baholashga olib keladi. Bunday holda, floresan yordamida miqdorni aniqlash muqobil bo'lishi mumkin. Ushbu uslub dsDNK bilan maxsus bog'langan lyuminestsent bo'yoqdan foydalanishga asoslangan bo'lib, faqat nuklein kislota va bo'yoqni o'z ichiga olgan kompleks yorug'lik bilan qo'zg'atiladi va keyinchalik u biroz yuqoriroq to'lqin uzunligidagi yorug'likni chiqaradi. Bu erda lyuminestsent signalning intensivligi DNK miqdoriga mutanosibdir va kontsentratsiyani aniqlash uchun u standart egri chiziqqa nisbatan baholanadi. Ushbu usulning afzalliklari ifloslanish natijasida yuzaga keladigan tashqi ta'sirlarni istisno qiladigan bog'lanishning o'ziga xos xususiyatiga, shuningdek, DNKning juda past konsentratsiyasini aniqlash qobiliyatiga bog'liq. Ikkala usulning mosligi asosan namuna konsentratsiyasi va tozaligiga bog'liq; ko'p hollarda ikkala usulni ham parallel ravishda qo'llash maqsadga muvofiq bo'lishi mumkin.
Yuborilgan vaqt: 30-noyabr-2022