نیوکلک ایسڈ نکالنے اور مقناطیسی مالا کا طریقہ

تعارف

نیوکلک ایسڈ نکالنا کیا ہے؟

سب سے آسان اصطلاحات میں، نیوکلک ایسڈ نکالنا ایک نمونے سے RNA اور/یا DNA کو ہٹانا ہے اور تمام اضافی جو ضروری نہیں ہے۔ نکالنے کا عمل نمونے سے نیوکلک ایسڈز کو الگ کرتا ہے اور انہیں ایک مرتکز ایلیویٹ کی شکل میں حاصل کرتا ہے، جو کہ کسی بھی بہاو والے ایپلی کیشنز کو متاثر کر سکتا ہے، ڈائیونٹ اور آلودگی سے پاک ہوتا ہے۔

نیوکلک ایسڈ نکالنے کی ایپلی کیشنز

پیوریفائیڈ نیوکلک ایسڈز کا استعمال متعدد مختلف صنعتوں میں مختلف ایپلی کیشنز کی کثرت میں کیا جاتا ہے۔ صحت کی دیکھ بھال شاید وہ علاقہ ہے جہاں اسے سب سے زیادہ استعمال کیا جاتا ہے، مختلف جانچ کے مختلف مقاصد کے لیے پیوریفائیڈ RNA اور DNA کی ضرورت ہوتی ہے۔

صحت کی دیکھ بھال میں نیوکلیک ایسڈ نکالنے کی درخواستوں میں شامل ہیں:

- پی سی آر اور کیو پی سی آر ایمپلیفیکیشن

- اگلی نسل کی ترتیب (NGS)

- ایمپلیفیکیشن پر مبنی SNP جین ٹائپنگ

- صف پر مبنی جین ٹائپنگ

- پابندی ینجائم عمل انہضام

- ترمیم کرنے والے خامروں کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کرتا ہے (مثلاً لیگیشن اور کلوننگ)

صحت کی دیکھ بھال کے علاوہ دیگر شعبے بھی ہیں جہاں نیوکلک ایسڈ نکالنے کا استعمال کیا جاتا ہے، بشمول پیٹرنٹی ٹیسٹنگ، فرانزکس اور جینومکس تک محدود نہیں۔

نیوکلک ایسڈ نکالنے کی مختصر تاریخ

ڈی این اے نکالنابہت پہلے کی تاریخ ہے، پہلی معلوم تنہائی 1869 میں فریڈرک میشر نامی ایک سوئس معالج نے کی تھی۔ میشر خلیات کی کیمیائی ساخت کا تعین کرکے زندگی کے بنیادی اصولوں کو حل کرنے کی امید کر رہے تھے۔ لیمفوسائٹس کے ساتھ ناکام ہونے کے بعد، وہ ضائع شدہ پٹیوں پر پیپ میں پائے جانے والے لیوکوسائٹس سے ڈی این اے کی خام مقدار حاصل کرنے میں کامیاب رہا۔ اس نے خلیے کے سائٹوپلازم کو چھوڑنے کے لیے خلیے میں تیزاب اور پھر الکلی شامل کرکے ایسا کیا، اور پھر ڈی این اے کو دوسرے پروٹینوں سے الگ کرنے کے لیے ایک پروٹوکول تیار کیا۔

Miescher کی زمینی تحقیق کے بعد، بہت سے دوسرے سائنسدانوں نے ڈی این اے کو الگ تھلگ اور پاک کرنے کی تکنیکوں کو آگے بڑھایا اور تیار کیا۔ ایڈون جوزف کوہن، ایک پروٹین سائنسدان نے WW2 کے دوران پروٹین صاف کرنے کے لیے بہت سی تکنیکیں تیار کیں۔ وہ خون کے پلازما کے سیرم البومین فریکشن کو الگ تھلگ کرنے کا ذمہ دار تھا، جو خون کی نالیوں میں آسموٹک پریشر کو برقرار رکھنے میں اہم ہے۔ فوجیوں کو زندہ رکھنے کے لیے یہ بہت ضروری تھا۔

1953 میں فرانسس کرک نے روزالنڈ فرینکلن اور جیمز واٹسن کے ساتھ مل کر ڈی این اے کی ساخت کا تعین کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ یہ نیوکلک ایسڈ نیوکلیوٹائڈس کی لمبی زنجیروں کے دو حصوں سے بنا تھا۔ اس پیش رفت کی دریافت نے Meselson اور Stahl کے لیے راہ ہموار کی، جو E. Coli بیکٹیریا سے DNA کو الگ تھلگ کرنے کے لیے کثافت گریڈینٹ سینٹرفیوگریشن پروٹوکول تیار کرنے میں کامیاب ہوئے کیونکہ انھوں نے 1958 کے تجربے کے دوران DNA کی نیم قدامت پسند نقل کا مظاہرہ کیا۔

نیوکلک ایسڈ نکالنے کی تکنیک

ڈی این اے نکالنے کے 4 مراحل کیا ہیں؟
نکالنے کے تمام طریقے ایک ہی بنیادی مراحل پر ابلتے ہیں۔

سیل میں خلل. یہ مرحلہ، جسے سیل لیسز بھی کہا جاتا ہے، سیل کی دیوار اور/یا سیل کی جھلی کو توڑنا شامل ہے، تاکہ انٹرا سیلولر سیالوں کو خارج کیا جا سکے جس میں دلچسپی کے نیوکلک ایسڈ ہوتے ہیں۔

ناپسندیدہ ملبے کو ہٹانا۔ اس میں جھلی لپڈ، پروٹین اور دیگر ناپسندیدہ نیوکلک ایسڈز شامل ہیں جو نیچے کی دھارے کے استعمال میں مداخلت کر سکتے ہیں۔

علیحدگی۔ آپ کے بنائے ہوئے کلیئرڈ لائسیٹ سے دلچسپی کے نیوکلیک ایسڈز کو الگ کرنے کے بہت سے مختلف طریقے ہیں، جو دو اہم زمروں کے درمیان آتے ہیں: حل پر مبنی یا ٹھوس حالت (اگلا حصہ دیکھیں)۔

ارتکاز۔ نیوکلک ایسڈز کو دیگر تمام آلودگیوں اور ملاوٹ سے الگ تھلگ کرنے کے بعد، انہیں انتہائی مرتکز ایلیویٹ میں پیش کیا جاتا ہے۔

نکالنے کی دو اقسام
نیوکلک ایسڈ نکالنے کی دو قسمیں ہیں - حل پر مبنی طریقے اور ٹھوس حالت کے طریقے۔ حل پر مبنی طریقہ کو کیمیکل نکالنے کا طریقہ بھی کہا جاتا ہے، کیونکہ اس میں سیل کو توڑنے اور نیوکلک مواد تک رسائی کے لیے کیمیکلز کا استعمال شامل ہے۔ یہ یا تو نامیاتی مرکبات جیسے فینول اور کلوروفارم، یا کم نقصان دہ اور اس لیے زیادہ تجویز کردہ غیر نامیاتی مرکبات جیسے کہ Proteinase K یا سلیکا جیل کا استعمال کر سکتے ہیں۔

سیل کو توڑنے کے لیے مختلف کیمیائی نکالنے کے طریقوں کی مثالیں شامل ہیں:

- جھلی کا آسموٹک پھٹنا

- سیل کی دیوار کا انزیمیٹک عمل انہضام

- جھلی کا حل

- ڈٹرجنٹ کے ساتھ

- الکلی علاج کے ساتھ

ٹھوس حالت کی تکنیکیں، جنہیں مکینیکل طریقوں کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، میں یہ استعمال کرنا شامل ہے کہ ڈی این اے ٹھوس سبسٹریٹ کے ساتھ کیسے تعامل کرتا ہے۔ ایک مالا یا مالیکیول کا انتخاب کرکے جس پر ڈی این اے باندھے گا لیکن تجزیہ کار نہیں کرے گا، دونوں کو الگ کرنا ممکن ہے۔ سیلیکا اور مقناطیسی موتیوں کا استعمال سمیت ٹھوس مرحلے نکالنے کی تکنیکوں کی مثالیں۔

مقناطیسی مالا نکالنے کی وضاحت کی گئی۔

مقناطیسی مالا نکالنے کا طریقہ
مقناطیسی موتیوں کا استعمال کرتے ہوئے نکالنے کی صلاحیت کو سب سے پہلے وائٹ ہیڈ انسٹی ٹیوٹ ریسرچ انسٹی ٹیوٹ کے لیے ٹریور ہاکنز کی طرف سے دائر کردہ امریکی پیٹنٹ میں تسلیم کیا گیا تھا۔ اس پیٹنٹ نے تسلیم کیا کہ جینیاتی مواد کو ٹھوس سپورٹ کیریئر کے ساتھ باندھ کر نکالنا ممکن تھا، جو مقناطیسی مالا ہو سکتا ہے۔ اصول یہ ہے کہ آپ ایک انتہائی فعال مقناطیسی مالا استعمال کرتے ہیں جس پر جینیاتی مواد جکڑے گا، جس کے بعد نمونے کو پکڑے ہوئے برتن کے باہر مقناطیسی قوت لگا کر اسے سپرنٹنٹ سے الگ کیا جا سکتا ہے۔

مقناطیسی مالا نکالنے کا استعمال کیوں کریں؟
مقناطیسی مالا نکالنے کی ٹیکنالوجی تیزی سے مقبول ہوتی جا رہی ہے، اس کی صلاحیت کی وجہ سے اس میں تیز رفتار اور موثر نکالنے کے طریقہ کار موجود ہیں۔ حالیہ دنوں میں مناسب بفر سسٹم کے ساتھ انتہائی فعال مقناطیسی موتیوں کی ترقی ہوئی ہے، جس نے نیوکلک ایسڈ نکالنے کی آٹومیشن اور ایک ورک فلو کو ممکن بنایا ہے جو بہت ہلکا اور کم خرچ ہے۔ اس کے علاوہ، مقناطیسی مالا نکالنے کے طریقوں میں سینٹرفیوگریشن کے اقدامات شامل نہیں ہیں جو قینچ کی قوتوں کا سبب بن سکتے ہیں جو ڈی این اے کے لمبے ٹکڑوں کو توڑ دیتے ہیں۔ اس کا مطلب ہے کہ ڈی این اے کے لمبے حصے برقرار رہتے ہیں، جو جینومکس ٹیسٹنگ میں اہم ہے۔