ہمیں اپنے پی سی آر ری ایکشن میں کتنا ٹیمپلیٹ شامل کرنا چاہیے؟

اگرچہ نظریہ میں، ٹیمپلیٹ کا ایک مالیکیول کافی ہوگا، ڈی این اے کی کافی بڑی مقدار کو عام طور پر کلاسک پی سی آر کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، مثال کے طور پر، جینومک ممالیہ ڈی این اے کے 1 µg تک اور پلاسمڈ ڈی این اے کے 1 pg تک۔ زیادہ سے زیادہ رقم کا انحصار ہدف کی ترتیب کی کاپیوں کی تعداد کے ساتھ ساتھ اس کی پیچیدگی پر بھی ہے۔

اگر بہت کم ٹیمپلیٹ استعمال کیا جاتا ہے، تو کافی مقدار میں پروڈکٹ حاصل کرنے کے لیے ایمپلیفیکیشن سائیکلوں کی تعداد میں اسی طرح اضافہ کی ضرورت ہوگی۔ ایک Taq پولیمریز جو زیادہ تر PCR تجربات کے لیے استعمال کیا جاتا ہے اس میں اصلاحی فعل نہیں ہوتا ہے (3′-5′ exonuclease سرگرمی)؛ اس طرح ایمپلیفیکیشن کے دوران ہونے والی غلطیوں کو درست نہیں کیا جا سکتا۔ سائیکلوں کی تعداد جتنی زیادہ ہوگی، ناقص پروڈکٹ کی افزائش اتنی ہی زیادہ ہوگی۔ اگر، دوسری طرف، ٹیمپلیٹ کی مقدار بہت زیادہ ہے تو، پرائمر کے دوسرے (سو فیصد اعزازی نہیں) تسلسل کے ساتھ منسلک ہونے کا امکان، نیز پرائمر ڈائمرز کی تشکیل میں اضافہ ہو جائے گا، جس کے نتیجے میں پرائمر کی توسیع ہو جائے گی۔ ضمنی مصنوعات بہت سے معاملات میں، ڈی این اے سیل ثقافتوں یا مائکروجنزموں سے الگ تھلگ ہوتا ہے اور بعد میں پی سی آر ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ طہارت کے بعد، پی سی آر سیٹ اپ کے لیے ضروری حجم کی وضاحت کرنے کے لیے ڈی این اے کے ارتکاز کا تعین کرنا ضروری ہے۔ اگرچہ ایگروز جیل الیکٹروفورسس ایک تخمینہ فراہم کرنے کے لئے کام کر سکتا ہے، یہ طریقہ درست سے دور ہے۔ UV-Vis spectrophotometry کو نیوکلک ایسڈ کی مقدار کے لیے سونے کے معیار کے طور پر قائم کیا گیا ہے۔ یہ براہ راست اور اس لیے آسان اور فوری طریقہ 260 nm پر نمونے کے جذب کی پیمائش کرتا ہے، اور ارتکاز کو تبادلوں کے عنصر کی مدد سے شمار کیا جاتا ہے۔

اگر ڈی این اے کا ارتکاز بہت کم ہے، تاہم (<1 µg/mL dsDNA)، یا اگر یہ ایسے مادوں سے آلودہ ہے جو 260 nm رینج (جیسے RNA، پروٹین، نمکیات) میں جذب ہوتے ہیں، تو یہ طریقہ اپنی حدود کو پہنچ جائے گا۔ بہت کم ارتکاز کی صورت میں، ریڈنگز جلد ہی استعمال کرنے کے لیے بہت غلط ہو جائیں گی، اور آلودگی اصل قدر کی حد سے زیادہ (بعض اوقات بہت زیادہ) کا باعث بنے گی۔ اس صورت میں، فلوروسینس کا استعمال کرتے ہوئے مقدار کا تعین ایک متبادل پیش کر سکتا ہے۔ یہ تکنیک فلوروسینٹ ڈائی کے استعمال پر مبنی ہے جو خاص طور پر dsDNA سے منسلک ہوتا ہے صرف نیوکلک ایسڈ اور ڈائی پر مشتمل کمپلیکس روشنی سے پرجوش ہوتا ہے، اور یہ بعد میں قدرے زیادہ طول موج کی روشنی خارج کرے گا۔ یہاں، فلوروسینٹ سگنل کی شدت ڈی این اے کی مقدار کے متناسب ہے، اور ارتکاز کا تعین کرنے کے لیے اس کا اندازہ معیاری وکر کے حوالے سے کیا جاتا ہے۔ اس طریقہ کار کے فوائد بانڈ کی خاصیت پر منحصر ہیں، جو آلودگی کے ذریعے متعارف کرائے گئے بیرونی اثرات کو خارج کرتا ہے، اور ساتھ ہی اس کے نتیجے میں ڈی این اے کی بہت کم ارتکاز کا پتہ لگانے کی صلاحیت پر بھی ہے۔ کسی بھی طریقہ کی مناسبیت کا انحصار بنیادی طور پر نمونے کے ارتکاز اور پاکیزگی پر ہوتا ہے۔ بہت سے معاملات میں دونوں طریقوں کو متوازی طور پر لاگو کرنے کا مشورہ بھی دیا جا سکتا ہے۔