ہمیں اپنے پی سی آر کے رد عمل میں کتنا ٹیمپلیٹ شامل کرنا چاہئے؟

اگرچہ نظریہ میں ، ٹیمپلیٹ کا ایک انو کافی ہوگا ، خاص طور پر ڈی این اے کی کافی بڑی مقدار عام طور پر کلاسک پی سی آر کے لئے استعمال کی جاتی ہے ، مثال کے طور پر ، 1 µg تک جینومک ممالیہ ڈی این اے اور کم سے کم 1 pg پلاسمیڈ ڈی این اے۔ زیادہ سے زیادہ رقم بڑی حد تک ہدف کی ترتیب کی کاپیاں کی تعداد کے ساتھ ساتھ اس کی پیچیدگی پر بھی منحصر ہے۔

اگر بہت کم ٹیمپلیٹ استعمال کیا جاتا ہے تو ، کافی مقدار میں مصنوعات کو حاصل کرنے کے لئے پروردن کے چکروں کی تعداد میں اسی طرح کے اضافے کی ضرورت ہوگی۔ ایک ٹی اے کیو پولیمریز جو زیادہ تر پی سی آر تجربات کے لئے استعمال ہوتا ہے اس میں اصلاحی فنکشن (3′-5 ′ exonuclease سرگرمی) کی خصوصیت نہیں ہے۔ اس طرح ، وسعت کے دوران ہونے والی غلطیوں کو درست نہیں کیا جاسکتا۔ سائیکلوں کی تعداد جتنی زیادہ ہوگی ، ناقص مصنوعات کی پرورش اتنی ہی زیادہ ہوگی۔ اگر ، دوسری طرف ، ٹیمپلیٹ کی مقدار بہت زیادہ ہے تو ، دوسرے (ایک سو فیصد نہیں) تسلسل کے ساتھ ساتھ پرائمر ڈائمر کی تشکیل میں پرائمر اینیلنگ کرنے کا امکان بڑھ جائے گا ، جس کے نتیجے میں وسعت پیدا ہوگی۔ ضمنی مصنوعات بہت سے معاملات میں ، ڈی این اے سیل ثقافتوں یا مائکروجنزموں سے الگ تھلگ ہوتا ہے اور اس کے بعد اسے پی سی آر ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ طہارت کے بعد ، ڈی این اے کی حراستی کا تعین کرنا ضروری ہے تاکہ پی سی آر سیٹ اپ کے ل required ضروری حجم کی وضاحت کرنے کے قابل ہو۔ اگرچہ ایگرز جیل الیکٹروفورسس ایک تخمینہ فراہم کرنے میں مدد فراہم کرسکتا ہے ، لیکن یہ طریقہ درست سے دور ہے۔ نیوکلیک ایسڈ کی مقدار کے لئے سونے کے معیار کے طور پر UV-VIS سپیکٹرو فوٹومیٹری قائم کی گئی ہے۔ یہ براہ راست اور اس لئے آسان اور تیز طریقہ 260 ینیم پر نمونے کے جذب کی پیمائش کرتا ہے ، اور تبادلوں کے عنصر کی مدد سے حراستی کا حساب لگایا جاتا ہے۔

اگر ڈی این اے کی حراستی بہت کم ہے ، تاہم (<1 µg/mL DSDNA) ، یا اگر یہ مادوں سے آلودہ ہے جو 260 این ایم رینج (جیسے آر این اے ، پروٹین ، نمکیات) میں بھی جذب ہوجاتا ہے تو ، یہ طریقہ اپنی حدود تک پہنچ جائے گا۔ بہت کم حراستی کی صورت میں ، ریڈنگ جلد ہی استعمال کے ل too بہت غلط ہوجائے گی ، اور آلودگیوں سے اصل قدر کی (کبھی کبھی بہت زیادہ) حد سے تجاوز کرنے کا باعث بنے گا۔ اس معاملے میں ، فلوروسینس کا استعمال کرتے ہوئے مقدار کا کوئی متبادل پیش کرسکتا ہے۔ یہ تکنیک فلوروسینٹ ڈائی کے استعمال پر مبنی ہے جو خاص طور پر ڈی ایس ڈی این اے سے منسلک ہوتی ہے صرف اس پیچیدہ پر مشتمل ہے جس میں نیوکلیک ایسڈ اور ڈائی روشنی سے بہت پرجوش ہوتی ہے ، اور اس کے نتیجے میں قدرے اونچی طول موج کی روشنی کو ختم ہوجائے گا۔ یہاں ، فلوروسینٹ سگنل کی شدت ڈی این اے کی مقدار کے متناسب ہے ، اور حراستی کا تعین کرنے کے لئے اس کا اندازہ ایک معیاری وکر کے سلسلے میں کیا جاتا ہے۔ اس طریقہ کار کے فوائد بانڈ کی خصوصیت پر باقی ہیں ، جو آلودگی کے ذریعہ متعارف کرائے گئے بیرونی اثرات کو خارج کرتا ہے ، نیز ڈی این اے کی بہت کم حراستی کا پتہ لگانے کی نتیجے میں ہونے والی صلاحیت پر بھی۔ کسی بھی طریقہ کار کی مناسبیت بنیادی طور پر نمونے کی حراستی اور پاکیزگی پر منحصر ہے۔ بہت سے معاملات میں یہاں تک کہ دونوں طریقوں کو متوازی طور پر لاگو کرنے کا مشورہ دیا جاسکتا ہے۔