Для успішних реакцій ампліфікації необхідно, щоб окремі компоненти реакції були присутні в правильній концентрації в кожному препараті. Крім того, важливо уникнути забруднення.
Особливо, коли потрібно налаштувати багато реакцій, було встановлено, що замість того, щоб піпетувати кожен реагент окремо в кожну посудину, готується так звана мастер-суміш. Комерційно доступні попередньо налаштовані суміші, до яких додаються лише специфічні для зразка компоненти (праймер) та вода. Крім того, мастер-суміш можна приготувати самостійно. В обох варіантах суміш розподіляється по кожній ПЛР-посудині без шаблону, а окремий зразок ДНК додається окремо в кінці.
Використання мастер-міксу має кілька переваг: по-перше, зменшується кількість кроків піпетування. Таким чином, мінімізується як ризик помилок користувача під час піпетування, так і ризик забруднення, і, звичайно, економиться час. В принципі, точність піпетування також вища, оскільки дозуються більші об'єми. Це легко зрозуміти, перевіряючи технічні дані піпеток: чим менший дозований об'єм, тим більшими можуть бути відхилення. Той факт, що всі препарати походять з однієї посудини, позитивно впливає на однорідність (за умови добре перемішування). Це також покращує відтворюваність експериментів.
Під час приготування мастер-суміші слід додати щонайменше 10% додаткового об'єму (наприклад, якщо потрібно 10 препаратів, розраховуйте на основі 11), щоб навіть остання посудина наповнилася належним чином. Таким чином, можна компенсувати (незначні) похибки піпетування та вплив втрати зразка під час дозування розчинів, що містять мийні засоби. Мийні засоби містяться в розчинах ферментів, таких як полімерази та мастер-суміші, що призводить до утворення піни та залишків на внутрішній поверхні нормальної...наконечники піпеток.
Залежно від застосування та типу рідини, що дозується, слід обрати правильну техніку піпетування (1) та відповідне обладнання. Для розчинів, що містять мийні засоби, рекомендується система прямого витіснення або так звані наконечники для піпеток «низького утримання» як альтернатива піпеткам на повітряній подушці. ВпливКінчик піпетки ACEбазується на особливо гідрофобній поверхні. Рідини, що містять миючі засоби, не залишають плівки на внутрішній та зовнішній сторонах, що мінімізує втрати розчину.
Окрім точного дозування всіх компонентів, важливо також уникнути забруднення препаратів. Недостатньо використовувати витратні матеріали високої чистоти, оскільки процес піпетування в піпетці з повітряною подушкою може призвести до утворення аерозолів, які залишаються в піпетці. ДНК, яка може міститися в аерозолі, може бути перенесена з одного зразка до наступного на наступному етапі піпетування, що призведе до забруднення. Згадані вище системи прямого витіснення також можуть мінімізувати цей ризик. Для піпеток з повітряною подушкою має сенс використовувати фільтруючі наконечники для захисту конуса піпетки, утримуючи бризки, аерозолі та біомолекули.
Час публікації: 06 грудня 2022 р.