Для успішних реакцій ампліфікації необхідно, щоб окремі компоненти реакції були присутні в правильній концентрації в кожному препараті. Крім того, важливо, щоб не відбулося забруднення.
Особливо, коли потрібно налагодити багато реакцій, було прийнято готувати так звану майстер-мікс замість перекачування кожного реагенту окремо в кожну посудину. Попередньо налаштовані суміші є комерційно доступними, до яких додаються лише специфічні для зразка компоненти (праймер) і вода. Як варіант, майстер-мікс можна приготувати самостійно. В обох варіантах суміш розподіляється в кожну посудину для ПЛР без матриці, а окремий зразок ДНК додається окремо в кінці.
Використання майстер-міксу має кілька переваг: По-перше, зменшується кількість окремих етапів дозування. Таким чином, як ризик помилок користувача під час дозування, так і ризик забруднення мінімізуються, і, звичайно, економиться час. В принципі, точність дозування також вища, оскільки дозуються більші об’єми. Це легко зрозуміти, перевіряючи технічні дані піпеток: чим менший дозований об’єм, тим вищими можуть бути відхилення. Той факт, що всі препарати надходять з однієї посудини, позитивно впливає на однорідність (якщо добре змішати). Це також покращує відтворюваність експериментів.
При приготуванні основної суміші слід додати принаймні 10 % додаткового об’єму (наприклад, якщо потрібно 10 приготування, розрахуйте на основі 11), щоб навіть остання ємність заповнювалася належним чином. Таким чином можна компенсувати (незначні) неточності дозування та вплив втрати зразка під час дозування розчинів, що містять мийний засіб. Миючі засоби містяться в ферментних розчинах, таких як полімерази та майстер-мікси, спричиняючи утворення піни та залишків на внутрішній поверхні звичайнихнаконечники піпеток.
Залежно від застосування та типу рідини, що дозується, слід вибрати правильну техніку дозування (1) і вибрати відповідне обладнання. Для розчинів, що містять мийні засоби, рекомендується використовувати систему прямого витіснення або так звані наконечники піпеток із «низьким утриманням» як альтернативу піпеткам на повітряній подушці. Ефект відНаконечник піпетки ACEґрунтується на особливо гідрофобній поверхні. Рідини, що містять миючі засоби, не залишають залишкової плівки всередині та зовні, тому втрату розчину можна мінімізувати.
Окрім точного дозування всіх компонентів, також важливо, щоб не відбулося забруднення препаратів. Недостатньо використовувати витратні матеріали високої чистоти, оскільки процес піпетування в піпетці на повітряній подушці може утворювати аерозолі, які залишаються в піпетці. ДНК, яка може міститися в аерозолі, може бути перенесена з одного зразка в наступний на наступному етапі піпетування, що призведе до забруднення. Згадані вище системи прямого переміщення також можуть мінімізувати цей ризик. Для піпеток на повітряній подушці має сенс використовувати наконечники фільтрів, щоб захистити конус піпетки шляхом утримання бризок, аерозолів і біомолекул.
Час публікації: 06 грудня 2022 р