Кріопробіркизазвичай використовуються для кріогенного зберігання клітинних ліній та інших критичних біологічних матеріалів у камерах Дьюара, наповнених рідким азотом.

Успішне збереження клітин у рідкому азоті включає кілька етапів. Хоча основним принципом є повільне заморожування, точна застосована техніка залежить від типу клітин і використовуваного кріопротектора. Існує кілька міркувань безпеки та найкращих практик, які слід враховувати під час зберігання клітин за таких низьких температур.

Ця публікація має на меті дати огляд того, як кріопробірки зберігаються в рідкому азоті.

Що таке кріопробірки

Кріопробірки — це маленькі флакони з кришкою, призначені для зберігання рідких зразків при надзвичайно низьких температурах. Вони гарантують, що клітини, збережені в кріопротекторі, не вступають у прямий контакт із рідким азотом, що мінімізує ризик руйнування клітин, водночас користуючись екстремальним ефектом охолодження рідкого азоту.

Флакони зазвичай доступні в різних обсягах і дизайнах – вони можуть мати внутрішню або зовнішню різьбу з плоским або заокругленим дном. Також доступні стерильні та нестерильні формати.

Хто використовуєЦировіалидля зберігання клітин у рідкому азоті

Низка NHS і приватних лабораторій, а також науково-дослідних установ, що спеціалізуються на збереженні пуповинної крові, біології епітеліальних клітин, імунології та біології стовбурових клітин, використовують кріопробірки для кріоконсервації клітин.

Клітини, збережені таким чином, включають B- і T-клітини, клітини CHO, гемопоетичні стовбурові клітини та клітини-попередники, гібридоми, кишкові клітини, макрофаги, мезенхімальні стовбурові клітини та клітини-попередники, моноцити, мієлому, NK-клітини та плюрипотентні стовбурові клітини.

Огляд того, як зберігати кріопробірки в рідкому азоті

Кріоконсервація — це процес збереження клітин та інших біологічних конструкцій шляхом їх охолодження до дуже низьких температур. Клітини можуть зберігатися в рідкому азоті роками без втрати життєздатності. Це нарис застосованих процедур.

Підготовка клітин

Точний метод підготовки зразків буде відрізнятися залежно від типу клітин, але загалом клітини збирають і центрифугують, щоб отримати осад, збагачений клітинами. Потім цей осад ресуспендують у надосадовій рідині, змішаній з кріопротектором або середовищем для кріоконсервації.

Середовище для кріоконсервації

Це середовище використовується для збереження клітин у низькотемпературних середовищах, яким вони будуть піддані, шляхом пригнічення утворення внутрішньо- та позаклітинних кристалів і, отже, загибелі клітин. Їх роль полягає у створенні безпечного захисного середовища для клітин і тканин під час процесів заморожування, зберігання та розморожування.

Середовище, таке як свіжозаморожена плазма (СЗП), гепаринований розчин плазмаліту або розчини без компонентів тваринного походження, які не містять сироватки, змішують із такими кріопротекторами, як диметилсульфоксид (ДМСО) або гліцерин.

Повторно зріджений осад зразка розподіляють на аліквоти в поліпропіленові кріопробірки, такі якSuzhou Ace Biomedical компанія Cryogenic Storage Vials.

Важливо не переповнювати кріопробірки, оскільки це збільшить ризик розтріскування та можливого вивільнення вмісту (1).

Контрольована швидкість заморожування

Загалом для успішного кріоконсервування клітин використовується повільна контрольована швидкість заморожування.

Після розподілу зразків у кріогенні флакони їх поміщають на вологий лід або в холодильник при температурі 4 ℃ і протягом 5 хвилин починають процедуру заморожування. Як правило, клітини охолоджуються зі швидкістю від -1 до -3 за хвилину (2). Це досягається за допомогою програмованого охолоджувача або шляхом розміщення флаконів в ізольованій коробці, поміщеній у морозильну камеру з контрольованою швидкістю від –70°C до –90°C.

Перенести в рідкий азот

Потім заморожені кріогенні флакони переносяться в резервуар з рідким азотом на невизначений період часу за умови підтримки температури нижче -135 ℃.

Ці наднизькі температури можна отримати шляхом занурення в рідку або парову фазу азоту.

Рідка чи парова фаза?

Відомо, що зберігання в рідкому азоті підтримує низьку температуру з абсолютною стабільністю, але часто не рекомендується з таких причин:

• Необхідність великих обсягів (глибини) рідкого азоту, що є потенційною небезпекою. Опіки або асфіксія через це є реальним ризиком.
• Задокументовані випадки перехресного зараження інфекційними агентами, такими як аспергілл, гепатит B та вірус, що поширюється через середовище рідкого азоту (2,3)
• Можливість витоку рідкого азоту у флакони під час занурення. При вилученні зі сховища і нагріванні до кімнатної температури азот швидко розширюється. Отже, флакон може розбитися, коли його виймають із сховища рідкого азоту, створюючи небезпеку як від розлітаючихся уламків, так і від контакту з вмістом (1, 4).

З цих причин зберігання при наднизькій температурі найчастіше здійснюється в паровій фазі азоту. Якщо зразки повинні зберігатися в рідкій фазі, слід використовувати спеціалізовані трубки Cryoflex.

Недоліком парової фази є те, що може виникнути вертикальний температурний градієнт, що призводить до коливань температури від -135 ℃ до -190 ℃. Це вимагає ретельного та ретельного моніторингу рівнів рідкого азоту та коливань температури (5).

Багато виробників рекомендують, щоб кріопробірки придатні для зберігання при температурі до -135 ℃ або для використання лише в паровій фазі.

Розморожування ваших кріоконсервованих клітин

Процедура розморожування є стресом для замороженої культури, і для забезпечення оптимальної життєздатності, відновлення та функціональності клітин необхідні належне поводження та техніка. Точні протоколи розморожування залежатимуть від конкретних типів клітин. Однак швидке розморожування вважається стандартним для:

• Зменшити будь-який вплив на відновлення клітин
• Допоможіть скоротити час впливу розчинених речовин, присутніх у середовищі для заморожування
• Зведіть до мінімуму будь-які пошкодження шляхом перекристалізації льоду

Для розморожування зразків зазвичай використовують водяні бані, ванни з кульками або спеціалізовані автоматизовані інструменти.

Найчастіше 1 клітинну лінію розморожують протягом 1-2 хвилин, обережно перемішуючи на водяній бані при 37 ℃, доки у флаконі не залишиться трохи льоду, перш ніж їх промивають у попередньо нагрітому середовищі для росту.

Для деяких клітин, таких як ембріони ссавців, повільне нагрівання є важливим для їх виживання.

Тепер клітини готові до культивування клітин, ізоляції клітин або, у випадку гемопоетичних стовбурових клітин, до дослідження життєздатності, щоб гарантувати цілісність донорських стовбурових клітин перед мієлоабляційною терапією.

Нормальною практикою є взяття невеликих аліквот попередньо промитого зразка, який використовується для підрахунку клітин для визначення концентрації клітин для посіву в культуру. Потім можна оцінити результати процедур ізоляції клітин і визначити життєздатність клітин.

Найкращі практики зберігання кріопробірок

Успішне кріоконсервування зразків, що зберігаються в кріопробірках, залежить від багатьох елементів у протоколі, включаючи належне зберігання та ведення записів.

• Розділіть комірки між місцями зберігання– Якщо обсяги дозволяють, розділіть клітини між флаконами та зберігайте їх в окремих місцях, щоб зменшити ризик втрати зразка через несправності обладнання.
• Запобігайте перехресному забрудненню– Вибирайте одноразові стерильні кріогенні флакони або автоклав перед подальшим використанням
• Використовуйте флакони відповідного розміру для своїх клітин– флакони випускаються в діапазоні об’ємів від 1 до 5 мл. Уникайте переповнення флаконів, щоб зменшити ризик розтріскування.
• Виберіть кріогенні флакони з внутрішнім або зовнішнім різьбленням– Деякі університети рекомендують флакони з внутрішньою різьбою для заходів безпеки – вони також можуть запобігти забрудненню під час наповнення або зберігання в рідкому азоті.
• Запобігання витоку- Використовуйте дворазові ущільнювачі, залиті в гвинтову кришку або ущільнювальні кільця, щоб запобігти витоку та забрудненню.
• Використовуйте 2D штрих-коди та маркуйте флакони– для забезпечення відстеження флакони з великими площами для написання дають змогу відповідним чином маркувати кожен флакон. Двовимірні штрих-коди можуть допомогти в управлінні зберіганням і веденні записів. Кришки з кольоровим кодом корисні для легшої ідентифікації.
• Належне обслуговування зберігання- Щоб клітини не були втрачені, у посудинах для зберігання слід постійно контролювати температуру та рівень рідкого азоту. Сигналізація повинна бути встановлена ​​для сповіщення користувачів про помилки.

Техніка безпеки

Рідкий азот став загальноприйнятою практикою в сучасних дослідженнях, але несе ризик серйозних травм у разі неправильного використання.

Необхідно використовувати відповідні засоби індивідуального захисту (ЗІЗ), щоб мінімізувати ризик обмороження, опіків та інших несприятливих випадків під час роботи з рідким азотом. Носити

• Кріогенні рукавички
• Халат лабораторний
• Ударостійкий щиток на все обличчя, який також закриває шию
• Закрите взуття
• Пластиковий фартух із захистом від бризок

Холодильники з рідким азотом слід розміщувати в добре провітрюваних приміщеннях, щоб мінімізувати ризик асфіксії – азот, що виділяється, випаровується та витісняє кисень повітря. Великі магазини повинні мати системи сигналізації про низький рівень кисню.

Працювати парами під час роботи з рідким азотом є ідеальним, і його використання поза звичайним робочим часом повинно бути заборонено.

Кріопробірки для підтримки вашого робочого процесу

Компанія Suzhou Ace Biomedical пропонує широкий вибір продуктів, які відповідають вашим потребам у кріоконсервації різних типів клітин. Портфоліо включає ряд трубок, а також ряд стерильних кріопробірок.

Наші кріопробірки це:

• Лабораторна гвинтова кришка 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл Кріопробірка з кріогенними флаконами з конічним дном і прокладкою

  ● Специфікація 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, із спідницею або без неї
  ● Конічна або самостійна конструкція, стерильна або нестерильна
  ● Пробірки, що загвинчуються, виготовлені з медичного поліпропілену
  ● PP Cryotube Vials можна багаторазово заморожувати та розморожувати
  ● Конструкція зовнішньої кришки може зменшити ймовірність забруднення під час обробки зразка.
  ● Кріогенні трубки з гвинтовою кришкою. Універсальна гвинтова різьба для використання
  ● Труби підходять для більшості поширених роторів
  ● Кріогенні трубки з ущільнювальним кільцем підходять до стандартних 1-дюймових і 2-дюймових, 48-, 81-, 96- і 100-лункових морозильних камер
  ● Автоклавується до 121°C і заморожується до -86°C

  ЧАСТИНА №	МАТЕРІАЛ	ОБ'ЄМ	CAPКОЛІР	PCS/СУМКА	СУМКИ/ЧЕХАЛ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10
  АКТ15-БЛ-Н	PP	1,5 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10