вступ
Що таке екстракція нуклеїнових кислот?
Якщо говорити найпростіше, екстракція нуклеїнової кислоти — це видалення РНК і/або ДНК із зразка та всього непотрібного. Процес екстракції виділяє нуклеїнові кислоти із зразка та дає їх у формі концентрованого елюату, вільного від розріджувачів і забруднюючих речовин, які можуть вплинути на будь-яке подальше застосування.
Застосування екстракції нуклеїнових кислот
Очищені нуклеїнові кислоти використовуються в багатьох галузях промисловості. Охорона здоров’я — це, мабуть, та сфера, де він використовується найбільше, оскільки очищені РНК і ДНК потрібні для безлічі різноманітних цілей тестування.
Застосування екстракції нуклеїнової кислоти в охороні здоров'я включає:
- Секвенування наступного покоління (NGS)
- Генотипування SNP на основі ампліфікації
- Генотипування на основі масиву
- Перетравлення ферментами рестрикції
- Аналізи з використанням модифікуючих ферментів (наприклад, лігування та клонування)
Окрім охорони здоров’я, існують також інші галузі, де використовується екстракція нуклеїнової кислоти, включаючи, але не обмежуючись, тестування на батьківство, криміналістику та геноміку.
Коротка історія екстракції нуклеїнових кислот
екстракція ДНКбере свій початок дуже давно: першу відому ізоляцію здійснив швейцарський лікар на ім’я Фрідріх Мішер у 1869 році. Мішер сподівався розгадати фундаментальні принципи життя, визначивши хімічний склад клітин. Після невдачі з лімфоцитами він зміг отримати грубий осад ДНК з лейкоцитів, знайдених у гної на викинутих бинтах. Він зробив це, додавши до клітини кислоту, а потім луг, щоб вийти з цитоплазми клітини, а потім розробив протокол для відділення ДНК від інших білків.
Після новаторських досліджень Мішера багато інших вчених пішли вперед і розробили методи виділення та очищення ДНК. Едвін Джозеф Кон, дослідник білка, розробив багато методів очищення білка під час Другої світової війни. Він відповідав за виділення фракції сироваткового альбуміну плазми крові, яка важлива для підтримки осмотичного тиску в кровоносних судинах. Це було вирішальним для збереження життя солдатів.
У 1953 році Френсіс Крік разом з Розаліндою Франклін і Джеймсом Уотсоном визначили структуру ДНК, показавши, що вона складається з двох ланцюгів довгих ланцюгів нуклеотидів нуклеїнових кислот. Це проривне відкриття проклало шлях для Мезелсона та Шталя, які змогли розробити протокол центрифугування в градієнті щільності для виділення ДНК з бактерій E. Coli, продемонструвавши напівконсервативну реплікацію ДНК під час свого експерименту 1958 року.
Методи екстракції нуклеїнових кислот
Які 4 етапи вилучення ДНК?
Усі методи вилучення зводяться до однакових основних кроків.
Порушення клітин. Ця стадія, також відома як клітинний лізис, включає руйнування клітинної стінки та/або клітинної мембрани з метою вивільнення внутрішньоклітинної рідини, що містить цікаві нуклеїнові кислоти.
Видалення небажаного сміття. Це включає мембранні ліпіди, білки та інші небажані нуклеїнові кислоти, які можуть перешкоджати подальшим застосуванням.
Ізоляція. Існує кілька різних способів виділення цікавих нуклеїнових кислот із створеного вами очищеного лізату, які діляться на дві основні категорії: на основі розчину або в твердому стані (див. наступний розділ).
Концентрація. Після того, як нуклеїнові кислоти були виділені з усіх інших забруднень і розчинників, вони представлені у висококонцентрованому елюаті.
Два типи екстракції
Існує два типи екстракції нуклеїнових кислот – методи на основі розчину та методи твердого стану. Метод на основі розчину також відомий як метод хімічної екстракції, оскільки він передбачає використання хімічних речовин для руйнування клітини та доступу до нуклеїнового матеріалу. Це може бути використання органічних сполук, таких як фенол і хлороформ, або менш шкідливих і тому більш рекомендованих неорганічних сполук, таких як протеїназа К або силікагель.
Приклади різних методів хімічної екстракції для руйнування клітини включають:
- Осмотичний розрив мембрани
- Ферментативне перетравлення клітинної стінки
- Солюбілізація мембрани
- З миючими засобами
- При обробці лугом
Методи твердого тіла, також відомі як механічні методи, передбачають використання того, як ДНК взаємодіє з твердим субстратом. Вибравши кульку або молекулу, з якою буде зв’язуватися ДНК, а аналіт – ні, можна відокремити їх. Приклади методів твердофазної екстракції, включаючи використання кремнезему та магнітних кульок.
Пояснення добування магнітних кульок
Метод екстракції магнітних кульок
Потенціал екстракції за допомогою магнітних кульок був вперше визнаний у патенті США, поданому Тревором Хокінсом для дослідницької установи Інституту Уайтхеда. У цьому патенті визнавалась можливість вилучення генетичного матеріалу шляхом прив’язування його до твердого опорного носія, яким може бути магнітна кулька. Принцип полягає в тому, що ви використовуєте високофункціональну магнітну кульку, на якій зв’язується генетичний матеріал, який потім можна відокремити від супернатанту шляхом застосування магнітної сили до зовнішньої сторони посудини, що містить зразок.
Навіщо використовувати екстракцію магнітних кульок?
Технологія екстракції магнітних кульок стає все більш поширеною завдяки потенціалу для швидкої та ефективної процедури екстракції. Останнім часом були розроблені високофункціональні магнітні кульки з відповідними буферними системами, які зробили можливою автоматизацію екстракції нуклеїнової кислоти та робочий процес, який є дуже легким і економічно ефективним. Крім того, методи екстракції магнітних кульок не передбачають етапів центрифугування, які можуть спричинити зусилля зсуву, що розбиває довші фрагменти ДНК. Це означає, що довші ланцюги ДНК залишаються недоторканими, що важливо при геномному тестуванні.
Час публікації: 25 листопада 2022 р