PCR ئىنكاسىمغا قانچىلىك قېلىپ قوشۇشىمىز كېرەك؟

گەرچە نەزەرىيە جەھەتتىن بولسىمۇ ، قېلىپنىڭ بىر مولېكۇلاسى يېتەرلىك بولسىمۇ ، ئادەتتە كلاسسىك PCR ئۈچۈن خېلى كۆپ مىقداردىكى DNA ئىشلىتىلىدۇ ، مەسىلەن ، 1 µg گېنلىق سۈت ئەمگۈچىلەرنىڭ DNA سى ۋە 1 كىلوگىرام پلازما DNA. ئەڭ مۇۋاپىق مىقدار كۆپىنچە نىشان تەرتىپىنىڭ كۆپەيتىلگەن سانىغا ، شۇنداقلا مۇرەككەپلىكىگە باغلىق.

ئەگەر ناھايىتى ئاز قېلىپ ئىشلىتىلگەن بولسا ، يېتەرلىك مەھسۇلاتقا ئېرىشىش ئۈچۈن كۈچەيتمە دەۋرىيلىك سانىنى ماس ھالدا ئاشۇرۇشقا توغرا كېلىدۇ. كۆپىنچە PCR تەجرىبىسىگە ئىشلىتىلىدىغان تاق پولىمېرازادا تۈزىتىش ئىقتىدارى يوق (3′-5 ′ exonuclease پائالىيىتى); شۇڭا ، كۈچەيتىش جەريانىدا يۈز بەرگەن خاتالىقلارنى تۈزەتكىلى بولمايدۇ. دەۋرىيلىك سانى قانچە كۆپ بولسا ، نۇقسانسىز مەھسۇلاتنىڭ كۈچەيتىلىشى شۇنچە ئومۇملىشىدۇ. يەنە بىر تەرەپتىن ، قېلىپنىڭ مىقدارى بەك كۆپ بولۇپ كەتسە ، پىرىمېرلارنىڭ باشقا (يۈز پىرسەنت ماختاش ئەمەس) تەرتىپكە باغلىنىش ئېھتىماللىقى ، شۇنداقلا دەسلەپكى ۋاقىت ئۆلچىمى شەكىللىنىش ئېھتىماللىقى ئېشىپ ، بۇ كۈچەيتىلىدۇ. by-products. نۇرغۇن ئەھۋاللاردا ، DNA ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدىن ياكى مىكرو ئورگانىزملاردىن ئايرىپ ، PCR قېلىپى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ. ساپلاشتۇرۇلغاندىن كېيىن ، DNA نىڭ قويۇقلۇقىنى ئېنىقلاپ ، PCR تەڭشەش ئۈچۈن تەلەپ قىلىنغان ئاۋاز مىقدارىنى بەلگىلىيەلەيمىز. گەرچە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېزى مۆلچەر بىلەن تەمىنلەش ئۈچۈن مۇلازىمەت قىلسىمۇ ، ئەمما بۇ ئۇسۇل توغرا ئەمەس. UV-Vis سپېكترو فوتومېتىرى يادرو كىسلاتاسىنى مىقدارلاشتۇرۇشنىڭ ئالتۇن ئۆلچىمى قىلىپ بېكىتىلدى. بۇ بىۋاسىتە ۋە شۇڭلاشقا ئاسان ۋە تېز ئۇسۇل ئەۋرىشكىنىڭ سۈمۈرۈلۈشىنى 260 nm قىلىپ ئۆلچەيدۇ ، قويۇقلۇقى ئايلىنىش ئامىلىنىڭ ياردىمىدە ھېسابلىنىدۇ.

ئەگەر DNA نىڭ قويۇقلۇقى ئىنتايىن تۆۋەن بولسا ، ئەمما (<1 µg / mL dsDNA) ياكى 260 nm دائىرىدە سۈمۈرۈلىدىغان ماددىلار بىلەن بۇلغانغان بولسا (مەسىلەن RNA ، ئاقسىل ، تۇز) ، بۇ ئۇسۇل چەكلىمىگە يېتىدۇ. قويۇقلۇقى ئىنتايىن تۆۋەن بولغان ئەھۋالدا ، ئوقۇش ناھايىتى تېزلا بەك توغرا بولۇپ قالىدۇ ، ھەمدە بۇلغىنىش ئەمەلىي قىممەتنى (بەزىدە غايەت زور) يۇقىرى مۆلچەرلەشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. بۇ خىل ئەھۋالدا فلۇئورېسسېنسىيە ئارقىلىق مىقدارلاشتۇرۇش باشقا تاللاشنى ئوتتۇرىغا قويۇشى مۇمكىن. بۇ تېخنىكا مەخسۇس dsDNA بىلەن تۇتىشىدىغان فلۇئورېسسېنسىيە بوياق ئىشلىتىشنى ئاساس قىلغان بولۇپ ، پەقەت يادرو كىسلاتاسى ۋە بوياقنى ئۆز ئىچىگە ئالغان مۇرەككەپ نۇر نۇرنى ھاياجانلاندۇرىدۇ ، ئۇ كېيىن سەل يۇقىرى دولقۇن ئۇزۇنلۇقىدىكى نۇر تارقىتىدۇ. بۇ يەردە ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ كۈچلۈكلۈكى DNA نىڭ مىقدارىغا ماس كېلىدۇ ، قويۇقلۇقىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق بىلەن باھالىنىدۇ. بۇ ئۇسۇلنىڭ ئەۋزەللىكى زايومنىڭ ئالاھىدىلىكىگە باغلىق ، ئۇ بۇلغىنىش كەلتۈرۈپ چىقارغان تاشقى تەسىرنى ئۆز ئىچىگە ئالمايدۇ ، شۇنداقلا DNA نىڭ ئىنتايىن تۆۋەن قويۇقلۇق دەرىجىسىنى بايقاش ئىقتىدارىغا باغلىق. ھەر ئىككى خىل ئۇسۇلنىڭ ماسلىشىشچانلىقى ئاساسلىقى ئەۋرىشكە قويۇقلۇقى ۋە ساپلىقىغا باغلىق. نۇرغۇن ئەھۋاللاردا ھەتتا ئىككى خىل ئۇسۇلنى پاراللېل قوللىنىش مۇۋاپىق بولۇشى مۇمكىن.