Теория буенча булса да, шаблонның бер молекуласы җитәрлек булыр иде, шактый зур күләмдә ДНК классик PCR өчен кулланыла, мәсәлән, 1 мг га кадәр геном имезүчеләрнең ДНКсы һәм 1 пг плазмид ДНК. Оптималь сумма күбесенчә максат эзлеклелегенең күчермәләре санына, шулай ук катлаулылыгына бәйле.
Әгәр дә бик аз шаблон кулланылса, җитәрлек күләмдә продукт алу өчен көчәйтү цикллары санының тиешле артуы кирәк булачак. Күпчелек PCR экспериментлары өчен кулланыла торган Так полимерасы коррекция функциясен күрсәтми (3′-5 ′ экзонуклаз эшчәнлеге); шулай итеп, көчәйтү вакытында булган хаталарны төзәтеп булмый. Cyикллар саны күп булса, җитешсез продуктны көчәйтү киң таралачак. Әгәр дә, киресенчә, шаблон күләме артык күп булса, праймерларның башка (йөз процент мактау түгел) эзлеклелегенә ябышу ихтималы, шулай ук праймер үлчәмнәре формалашу көчәячәк, бу көчәйтеләчәк. продуктлар. Күп очракта, ДНК күзәнәк культураларыннан яки микроорганизмнардан изоляцияләнә һәм соңыннан PCR шаблоны буларак кулланыла. Чистартудан соң, PCR урнаштыру өчен кирәк булган күләмне билгели алу өчен, ДНК концентрациясен билгеләргә кирәк. Агароза гели электрофорезы смета бирергә хезмәт итә алса да, бу ысул төгәл түгел. UV-Vis спектропотометриясе нуклеин кислоталарын санлау өчен алтын стандарт итеп билгеләнде; бу туры һәм шуңа күрә җиңел һәм тиз ысул 260 нмда үрнәкнең үзләштерүен үлчәя, һәм концентрация конверсия факторы ярдәмендә исәпләнә.
Әгәр дә ДНК концентрациясе бик түбән булса, (<1 µg / mL dsDNA), яки 260 нм диапазонына сеңгән матдәләр белән пычранган булса (мәсәлән, РНК, протеин, тоз), бу ысул аның чикләренә ирешәчәк. Бик аз концентрация булган очракта, укулар тиз арада куллану өчен бик төгәл булмаячак, һәм пычрану фактик кыйммәтне (кайвакыт гаять зур) бәяләүгә китерәчәк. Бу очракта, флуоресцент кулланып санлаштыру альтернатива күрсәтергә мөмкин. Бу техника dsDNA белән махсус бәйләнгән флуоресцент буяуны куллануга нигезләнгән, нуклеин кислотасы һәм буяуны үз эченә алган комплекс яктылык белән дулкынландыра, һәм соңрак ул бераз югарырак дулкын озынлыгы яктылыгын чыгарачак. Монда, флюоресцент сигналның интенсивлыгы ДНК күләменә пропорциональ, һәм концентрацияне билгеләү өчен ул стандарт кәкрегә карата бәяләнә. Бу ысулның өстенлекләре бәйләнешнең үзенчәлегенә бәйле, ул пычрану белән кертелгән тышкы тәэсирне, шулай ук ДНКның бик аз концентрацияләрен ачыклау сәләтенә бәйле. Ике ысулның да яраклылыгы, нигездә, концентрация һәм чисталыкка бәйле; күп очракта хәтта ике ысулны да параллель куллану киңәш ителергә мөмкин.
Пост вакыты: 30-2022 ноябрь