Başarılı amplifikasyon reaksiyonları için, bireysel reaksiyon bileşenlerinin her preparatta doğru konsantrasyonda mevcut olması gerekir. Ayrıca herhangi bir kirlenmenin meydana gelmemesi de önemlidir.
Özellikle birçok reaksiyonun ayarlanması gerektiğinde, her bir reaktifin her bir kaba ayrı ayrı pipetlenmesi yerine ana karışım adı verilen bir karışımın hazırlanmasına karar verilmiştir. Yalnızca numuneye özgü bileşenlerin (astar) ve suyun eklendiği önceden yapılandırılmış karışımlar ticari olarak mevcuttur. Alternatif olarak ana karışımı kendiniz de hazırlayabilirsiniz. Her iki varyantta da karışım her bir PCR kabına şablon olmadan dağıtılır ve sonunda ayrı ayrı DNA örneği eklenir.
Ana karışım kullanmanın birçok avantajı vardır: Birincisi, tek pipetleme adımlarının sayısı azalır. Bu sayede hem pipetleme sırasında kullanıcı hatası riski hem de kontaminasyon riski en aza indirilir ve tabii ki zamandan da tasarruf sağlanır. Prensip olarak, daha büyük hacimler dozlandığından pipetleme doğruluğu da daha yüksektir. Pipetlerin teknik verilerini kontrol ederken bunu anlamak kolaydır: Dozlanan hacim ne kadar küçük olursa sapmalar da o kadar yüksek olabilir. Tüm preparatların aynı kaptan gelmesi (iyi karıştırılmışsa) homojenliğe olumlu etki yapar. Bu aynı zamanda deneylerin tekrarlanabilirliğini de artırır.
Ana karışımı hazırlarken, son kabın bile düzgün şekilde doldurulması için en az %10 ekstra hacim eklenmelidir (örneğin, 10 preparat gerekiyorsa, 11'i esas alarak hesaplayın). Bu şekilde (hafif) pipetleme hataları ve deterjan içeren solüsyonların dozlanması sırasında oluşan numune kaybının etkisi telafi edilebilir. Deterjanlar polimerazlar ve ana karışımlar gibi enzim çözeltilerinin içinde bulunarak normalin iç yüzeyinde köpük oluşumuna ve kalıntılara neden olur.pipet uçları.
Uygulamaya ve dağıtılacak sıvının türüne bağlı olarak doğru pipetleme tekniği (1) seçilmeli ve uygun ekipman seçilmelidir. Deterjan içeren çözeltiler için, hava yastıklı pipetlere alternatif olarak doğrudan yer değiştirme sistemi veya "düşük tutmalı" pipet uçları önerilir. etkisiACE PİPET ucuözellikle hidrofobik bir yüzeye dayanmaktadır. Deterjan içeren sıvılar içte ve dışta kalıntı film bırakmaz, böylece çözelti kaybı en aza indirilebilir.
Tüm bileşenlerin tam dozajının yanı sıra preparatlarda herhangi bir kontaminasyonun meydana gelmemesi de önemlidir. Yüksek saflıkta sarf malzemelerinin kullanılması yeterli değildir çünkü hava yastıklı pipette pipetleme işlemi pipette kalan aerosoller üretebilir. Aerosolde bulunabilecek DNA, bir sonraki pipetleme adımında bir numuneden diğerine aktarılabilir ve dolayısıyla kontaminasyona yol açabilir. Yukarıda bahsedilen doğrudan yer değiştirme sistemleri de bu riski en aza indirebilir. Hava yastıklı pipetler için, sıçramaları, aerosolleri ve biyomolekülleri tutarak pipet konisini korumak için filtre uçlarının kullanılması mantıklıdır.
Gönderim zamanı: Aralık-06-2022