Dondurucu şişelerGenellikle hücre dizilerinin ve diğer kritik biyolojik materyallerin sıvı nitrojenle dolu dewarlarda kriyojenik depolanması için kullanılır.

Hücrelerin sıvı nitrojende başarılı bir şekilde korunmasında çeşitli aşamalar vardır. Temel prensip yavaş dondurma olsa da, kullanılan teknik, kullanılan hücre tipine ve kriyoprotektana bağlıdır. Hücreleri bu kadar düşük sıcaklıklarda saklarken dikkate alınması gereken çeşitli güvenlik hususları ve en iyi uygulamalar vardır.

Bu yazı, dondurarak saklama şişelerinin sıvı nitrojende nasıl depolandığına dair genel bir bakış sunmayı amaçlamaktadır.

Kriyovyaller Nedir?

Kriyovyaller, sıvı numunelerin son derece düşük sıcaklıklarda saklanması için tasarlanmış küçük, kapaklı şişelerdir. Kriyoprotektan içinde korunan hücrelerin sıvı nitrojenle doğrudan temas etmemesini sağlarlar, böylece hücresel kırılma riskini en aza indirirken sıvı nitrojenin aşırı soğutma etkisinden de faydalanırlar.

Şişeler genellikle çeşitli hacimlerde ve tasarımlarda mevcuttur; düz veya yuvarlak tabanlı, içten veya dıştan dişli olabilirler. Steril ve steril olmayan formatlar da mevcuttur.

Kim Kullanır?Cyrovial'lerHücreleri Sıvı Nitrojende Depolamak

Bir dizi NHS ve özel laboratuvarın yanı sıra kordon kanı bankacılığı, epitel hücre biyolojisi, immünoloji ve kök hücre biyolojisi konularında uzmanlaşmış araştırma kurumları, hücreleri dondurarak saklamak için kriyoviyaller kullanır.

Bu şekilde korunan hücreler arasında B ve T Hücreleri, CHO Hücreleri, Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücreler, Hibridomalar, Bağırsak Hücreleri, Makrofajlar, Mezenkimal Kök ve Progenitör Hücreler, Monositler, Miyelom, NK Hücreleri ve Pluripotent Kök Hücreler bulunur.

Kriyovyallerin Sıvı Nitrojende Nasıl Saklanacağına Genel Bakış

Kriyoprezervasyon, hücreleri ve diğer biyolojik yapıları çok düşük sıcaklıklara soğutarak koruyan bir işlemdir. Hücreler, hücre canlılığı kaybı olmadan yıllarca sıvı nitrojende saklanabilir. Bu, uygulanan prosedürlerin bir özetidir.

Hücre Hazırlığı

Numunelerin hazırlanmasına yönelik kesin yöntem, hücre tipine bağlı olarak değişecektir ancak genel olarak hücreler toplanır ve hücre açısından zengin bir pelet geliştirmek için santrifüjlenir. Bu pelet daha sonra kriyoprotektan veya kriyoprezervasyon ortamı ile karıştırılmış süpernatan içerisinde yeniden süspanse edilir.

Kriyoprezervasyon Ortamı

Bu ortam, hücre içi ve hücre dışı kristal oluşumunu ve dolayısıyla hücre ölümünü engelleyerek hücreleri maruz kalacakları düşük sıcaklıktaki ortamlarda korumak için kullanılır. Görevleri, dondurma, depolama ve çözme işlemleri sırasında hücreler ve dokular için güvenli, koruyucu bir ortam sağlamaktır.

Taze dondurulmuş plazma (FFP), heparinize plazmalit çözeltisi veya serumsuz, hayvan bileşeni içermeyen çözeltiler gibi bir ortam, dimetil sülfoksit (DMSO) veya gliserol gibi kriyoprotektanlarla karıştırılır.

Yeniden sıvılaştırılmış numune peleti, aşağıdaki gibi polipropilen kriyovyallere bölünürSuzhou Ace Biyomedikal şirketi Kriyojenik Depolama Şişeleri.

Dondurucu şişelerin aşırı doldurulmaması önemlidir çünkü bu, çatlama riskini ve içeriğin olası salınımını artıracaktır (1).

Kontrollü Donma Oranı

Genel olarak hücrelerin başarılı bir şekilde dondurularak saklanması için yavaş kontrollü bir dondurma hızı kullanılır.

Numuneler kriyojenik şişelere bölündükten sonra ıslak buz üzerine veya 4°C'lik buzdolabına yerleştirilir ve 5 dakika içinde dondurma işlemi başlatılır. Genel bir kural olarak hücreler dakikada -1 ila -3 oranında soğutulur (2). Bu, programlanabilir bir soğutucu kullanılarak veya şişelerin –70°C ila –90°C kontrollü oranlı dondurucuya yerleştirilmiş yalıtımlı bir kutuya yerleştirilmesiyle elde edilir.

Sıvı Azot'a Transfer

Dondurulmuş kriyojenik şişeler daha sonra sıcaklığın -135°C'nin altında tutulması koşuluyla belirsiz süreler boyunca bir sıvı nitrojen tankına aktarılır.

Bu ultra düşük sıcaklıklar, sıvı veya buhar fazındaki nitrojene daldırılarak elde edilebilir.

Sıvı veya Buhar Aşaması?

Sıvı faz nitrojende depolamanın soğuk sıcaklığı mutlak tutarlılıkla koruduğu bilinmektedir, ancak aşağıdaki nedenlerden dolayı genellikle önerilmez:

• Potansiyel bir tehlike olan büyük hacimlerde (derinlik) sıvı nitrojen ihtiyacı. Bundan dolayı yanma veya boğulma gerçek bir risktir.
• Aspergillus, hep B gibi bulaşıcı ajanlar tarafından belgelenen çapraz kontaminasyon ve sıvı nitrojen ortamı yoluyla viral yayılma vakaları (2,3)
• Daldırma sırasında sıvı nitrojenin şişelere sızma potansiyeli. Depodan çıkarıldığında ve oda sıcaklığına ısıtıldığında nitrojen hızla genişler. Sonuç olarak, sıvı nitrojen deposundan çıkarıldığında flakon parçalanabilir, bu da hem döküntülerin uçması hem de içindekilere maruz kalma nedeniyle tehlike oluşturabilir (1, 4).

Bu nedenlerden dolayı, ultra düşük sıcaklıkta depolama en yaygın olarak buhar fazındaki nitrojende yapılır. Numunelerin sıvı fazda saklanması gerektiğinde, özel kriyofleks tüpler kullanılmalıdır.

Buhar fazının dezavantajı, -135°C ile -190°C arasında sıcaklık dalgalanmalarına neden olan dikey bir sıcaklık gradyanının meydana gelebilmesidir. Bu, sıvı nitrojen seviyelerinin ve sıcaklık değişimlerinin dikkatli ve özenli bir şekilde izlenmesini gerektirir (5).

Birçok üretici, dondurarak saklama şişelerinin -135°C'ye kadar depolamaya veya yalnızca buhar fazında kullanıma uygun olduğunu önermektedir.

Dondurulmuş Hücrelerinizi Çözdürmek

Çözdürme prosedürü donmuş bir kültür için streslidir ve hücrelerin optimal canlılığını, iyileşmesini ve işlevselliğini sağlamak için uygun kullanım ve teknik gereklidir. Tam çözülme protokolleri belirli hücre türlerine bağlı olacaktır. Ancak hızlı eritme aşağıdaki durumlarda standart kabul edilir:

• Hücresel iyileşme üzerindeki her türlü etkiyi azaltın
• Dondurucu ortamda bulunan çözünen maddelere maruz kalma süresinin azaltılmasına yardımcı olun
• Buzun yeniden kristalleşmesinden kaynaklanan hasarları en aza indirin

Numuneleri eritmek için genellikle su banyoları, boncuk banyoları veya özel otomatik aletler kullanılır.

Çoğu zaman 1 hücre çizgisi, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamında yıkanmadan önce, şişede sadece küçük bir miktar buz kalana kadar 37°C'lik bir su banyosunda hafifçe döndürülerek 1-2 dakika boyunca bir seferde eritilir.

Memeli embriyoları gibi bazı hücrelerin hayatta kalmaları için yavaş ısınma şarttır.

Hücreler artık hücre kültürü, hücre izolasyonu veya hematopoietik kök hücre durumunda, miyeloablatif tedaviden önce donör kök hücrelerinin bütünlüğünü garanti altına almak için canlılık çalışmaları için hazırdır.

Kültürde kaplama için hücre konsantrasyonlarını belirlemek amacıyla hücre sayımı yapmak için kullanılan önceden yıkanmış numuneden küçük porsiyonlar almak normal bir uygulamadır. Daha sonra hücre izolasyon prosedürlerinin sonuçlarını değerlendirebilir ve hücre canlılığını belirleyebilirsiniz.

Dondurulmuş Şişelerin Saklanmasına İlişkin En İyi Uygulamalar

Dondurarak saklama şişelerinde saklanan numunelerin başarılı bir şekilde dondurularak saklanması, uygun saklama ve kayıt tutma dahil olmak üzere protokoldeki birçok unsura bağlıdır.

• Hücreleri depolama konumları arasında bölme– Hacim izin veriyorsa hücreleri şişeler arasında bölün ve ekipman arızalarından dolayı numune kaybı riskini azaltmak için bunları ayrı konumlarda saklayın.
• Çapraz bulaşmayı önleyin– Daha sonraki kullanımdan önce tek kullanımlık steril kriyojenik şişeleri veya otoklavı tercih edin
• Hücreleriniz için uygun boyuttaki şişeleri kullanın– şişeler 1 ile 5 ml arasında değişen hacimlerde gelir. Çatlama riskini azaltmak için şişeleri aşırı doldurmaktan kaçının.
• İçten veya dıştan dişli kriyojenik şişeleri seçin– İçten dişli şişeler bazı üniversiteler tarafından güvenlik önlemleri açısından tavsiye edilmektedir; ayrıca dolum sırasında veya sıvı nitrojende saklandığında kontaminasyonu da önleyebilirler.
• Sızıntıyı Önleyin- Sızıntıyı ve kirlenmeyi önlemek için vidalı kapak veya O-halkalara kalıplanmış çift enjeksiyonlu contalar kullanın.
• 2D barkodları ve etiket şişelerini kullanın– izlenebilirliği sağlamak için geniş yazma alanlarına sahip şişeler, her şişenin yeterli şekilde etiketlenmesini sağlar. 2D barkodlar depolama yönetimi ve kayıt tutma konusunda yardımcı olabilir. Renk kodlu kapaklar daha kolay tanımlama için kullanışlıdır.
• Yeterli depolama bakımı- Hücrelerin kaybolmamasını sağlamak için depolama kapları sıcaklığı ve sıvı nitrojen seviyelerini sürekli izlemelidir. Kullanıcıları hatalar konusunda uyarmak için alarmlar takılmalıdır.

Güvenlik Önlemleri

Sıvı nitrojen modern araştırmalarda yaygın bir uygulama haline gelmiştir ancak yanlış kullanıldığında ciddi yaralanma riski taşır.

Sıvı nitrojenle çalışırken donma, yanık ve diğer olumsuz olaylar riskini en aza indirmek için uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyilmelidir. Giymek

• Kriyojenik eldivenler
• Laboratuvar önlüğü
• Boynu da kaplayan, darbeye dayanıklı tam yüz siperi
• Burnu kapalı ayakkabılar
• Sıçramaya dayanıklı plastik önlük

Sıvı nitrojen buzdolapları, boğulma riskini en aza indirmek için iyi havalandırılan alanlara yerleştirilmelidir; kaçan nitrojen buharlaşır ve atmosferik oksijenin yerini alır. Büyük hacimli mağazalarda düşük oksijen alarm sistemleri bulunmalıdır.

Sıvı nitrojenle çalışırken çiftler halinde çalışmak idealdir ve normal çalışma saatleri dışında kullanılması yasaklanmalıdır.

İş Akışınızı Destekleyecek Kriyovyaller

Suzhou Ace Biyomedikal şirketi, farklı hücre türlerine yönelik kriyoprezervasyon ihtiyaçlarınızı karşılayan geniş bir ürün yelpazesi sunmaktadır. Portföyde bir dizi tüpün yanı sıra bir dizi steril dondurarak saklama şişeleri de bulunmaktadır.

Kriyovyallerimiz:

• Laboratuvar Vidalı Kapak 0.5mL 1.5mL 2.0mL Cryovial Kriyojenik Şişeler Contalı Konik Alt Cryotube

  ● 0,5ml,1,5ml,2,0ml spesifikasyonu, etekli veya eteksiz
  ● Konik veya kendi kendine ayakta duran tasarım, steril veya steril olmayan seçeneklerin her ikisi de mevcuttur
  ● Vidalı kapaklı tüpler tıbbi sınıf polipropilenden yapılmıştır
  ● PP Cryotube Şişeleri tekrar tekrar dondurulup çözülebilir
  ●Harici kapak tasarımı numune işleme sırasında kontaminasyon olasılığını azaltabilir.
  ● Vida kapaklı kriyojenik tüpler Kullanım için evrensel vida dişleri
  ● Borular en yaygın rotorlara uygundur
  ● Kriyojenik tüp o-halkalı tüpler standart 1 inç ve 2 inç, 48 kuyulu, 81 kuyulu, 96 kuyulu ve 100 kuyulu dondurucu kutularına uygundur
  ● 121°C'ye kadar otoklavlanabilir ve -86°C'ye kadar dondurulabilir

  PARÇA NO	MALZEME	HACİM	KAPRENK	adet/ÇANTA	ÇANTA/KASA
  ACT05-BL-N	PP	0.5ML	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10