Süreçlerin standardizasyonu, kullanıcıdan bağımsız olarak uzun vadeli optimum performansı mümkün kılan optimizasyonu ve müteakip kurulum ve uyumlaştırmayı içerir. Standardizasyon, yüksek kaliteli sonuçların yanı sıra bunların tekrarlanabilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini de sağlar.
(Klasik) PCR'nin amacı güvenilir ve tekrarlanabilir bir sonuç üretmektir. Belirli uygulamalar için verimPCR ürünüaynı zamanda konuyla da ilgilidir. Bu reaksiyonlar için numunelerin bozulmadığından ve PCR iş akışının stabil kaldığından emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Spesifik olarak bu, yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlara yol açabilecek ve hatta PCR reaksiyonunu inhibe edebilecek kontaminasyonların ortaya çıkmasının en aza indirilmesi anlamına gelir. Ayrıca reaksiyon koşulları, bir çalışmadaki her bir numune için mümkün olduğu kadar aynı olmalı ve ayrıca (aynı yöntemin) sonraki reaksiyonlara aktarılabilir olmalıdır. Bu, reaksiyonların bileşiminin yanı sıra döngüleyicideki sıcaklık kontrolünün tipini de ifade eder. Elbette kullanıcı hatalarından mümkün olduğunca kaçınılmalıdır.
Aşağıda, bir PCR'nin hazırlanması sırasında ve çalıştırılması sırasında karşılaşılan zorlukları ve PCR iş akışlarının standardizasyonu için kullanılan aletler ve sarf malzemeleriyle ilgili mevcut çözümlere yönelik yaklaşımları göstereceğiz.
Reaksiyon hazırlığı
Reaksiyon bileşenlerinin sırasıyla PCR kaplarına veya plakalara dağıtılması, aşılması gereken birçok zorluğu içerir:
Reaksiyon koşulları
Mümkün olan en benzer reaksiyon koşullarını hedeflerken, ayrı ayrı bileşenlerin tam ve kesin dozajı vazgeçilmezdir. İyi bir pipetleme tekniğinin yanı sıra doğru aletin seçilmesi de kritik öneme sahiptir. PCR ana karışımları sıklıkla viskoziteyi artıran veya köpük oluşturan maddeler içerir. Pipetleme işlemi sırasında bunlar önemli ölçüde ıslanmaya neden olur.pipet uçlarıbu da pipetleme doğruluğunu azaltır. Doğrudan dağıtım sistemlerinin veya ıslanmaya daha az eğilimli alternatif pipet uçlarının kullanılması, pipetleme işleminin doğruluğunu ve hassasiyetini artırabilir.
Kirlenmeler
Dağıtım işlemi sırasında, pipetin içine erişmesine izin verilirse bir sonraki pipetleme adımı sırasında başka bir numuneyi kirletme potansiyeline sahip aerosoller üretilir. Bu, filtre uçları veya doğrudan yer değiştirme sistemleri kullanılarak önlenebilir.
Gibi sarf malzemeleriipuçlarıPCR iş akışında kullanılan kaplar ve plakalar, numuneyi tehlikeye atacak veya sonucu yanıltacak maddeler içermemelidir. Bunlar arasında DNA, DNazlar, RNazlar ve PCR inhibitörlerinin yanı sıra reaksiyon sırasında materyalden potansiyel olarak sızabilecek bileşenler (sızıntı yapılabilir maddeler olarak bilinen maddeler) yer alır.
Kullanıcı hatası
Ne kadar çok örnek işlenirse hata riski de o kadar yüksek olur. Bir numunenin yanlış kaba veya yanlış kuyuya pipetlenmesi kolaylıkla gerçekleşebilir. Kuyuların kolaylıkla fark edilebilecek şekilde işaretlenmesiyle bu risk önemli ölçüde azaltılabilir. Dağıtım adımlarının otomasyonu sayesinde "insan faktörü", yani hatalar ve kullanıcıyla ilgili değişiklikler en aza indirilir, böylece özellikle küçük reaksiyon hacimleri durumunda tekrarlanabilirlik artar. Bu, bir iş istasyonunda yeterli boyutsal stabiliteye sahip plakaların kullanılmasını gerektirir. Ekli barkodlar, makine tarafından okunabilirliği artırarak tüm süreç boyunca numune takibini basitleştirir.
Termocycler'ın programlanması
Bir enstrümanın programlanması hem zaman alıcı hem de hataya açık olabilir. Farklı PCR termal döngüleyici özellikleri, bu işlem adımını basitleştirmek ve en önemlisi onu güvenli kılmak için birlikte çalışır:
Kolay kullanım ve iyi kullanıcı rehberliği, verimli programlamanın temelidir. Bu temel üzerine inşa edilen parola korumalı kullanıcı yönetimi, kişinin kendi programlarının diğer kullanıcılar tarafından değiştirilmesini önleyecektir. Birden fazla döngüleyici (aynı türden) kullanılıyorsa, bir programın USB veya bağlantı aracılığıyla doğrudan bir cihazdan diğerine aktarılabilmesi faydalı olur. Bilgisayar yazılımı, bilgisayardaki programların, kullanıcı haklarının ve belgelerin merkezi ve güvenli bir şekilde yönetilmesini sağlar.
PCR çalışması
Çalışma sırasında DNA, her numunenin aynı, tutarlı reaksiyon koşullarına tabi tutulması gereken reaksiyon kabında amplifiye edilir. Aşağıdaki hususlar süreçle ilgilidir:
Sıcaklık kontrolü
Sıcaklık kontrolünde mükemmel doğruluk ve döngüleyici bloğun homojenliği, tüm numunelerin eşit sıcaklık koşullandırmasının temelini oluşturur. Isıtma ve soğutma elemanlarının (peltier elemanları) yüksek kalitesi ve bunların bloğa bağlanma şekli, “kenar etkisi” olarak bilinen sıcaklık farklılıkları riskini belirleyecek belirleyici faktörlerdir.
Buharlaşma
Bireysel reaksiyon bileşenlerinin konsantrasyonları, buharlaşmaya bağlı olarak reaksiyon süresince değişmemelidir. Aksi halde çok az şey olması mümkündür.PCR ürünüoluşturulabilir veya hiç oluşturulmayabilir. Bu nedenle güvenli bir sızdırmazlık sağlayarak buharlaşmayı en aza indirmek çok önemlidir. Bu durumda, termocycler'ın ısıtılmış kapağı ve kabın contası el ele çalışır. için farklı sızdırmazlık seçenekleri mevcuttur.PCR plakaları (bağlantı: Sızdırmazlık makalesi)Bu sayede en iyi sızdırmazlık, ısıyla yapıştırma yoluyla elde edilir. Döngüleyici kapağının temas basıncı seçilen contaya ayarlanabildiği sürece diğer kapaklar da uygun olabilir.
Uzun vadede doğru ve tekrarlanabilir sonuçları korumak için proses standardizasyonu mevcuttur. Bu, ekipmanın her zaman iyi çalışır durumda olmasını sağlamak için ekipmanın düzenli bakımını içerir. Üretilen tüm partilerde tüm sarf malzemeleri tutarlı bir şekilde yüksek kalitede olmalı ve bunların güvenilir bulunabilirliği garanti edilmelidir.
Gönderim zamanı: Kasım-29-2022