giriiş
Nükleik Asit Ekstraksiyonu Nedir?
En basit ifadeyle, nükleik asit ekstraksiyonu, bir numuneden RNA ve/veya DNA'nın ve gerekli olmayan tüm fazlalığın çıkarılmasıdır. Ekstraksiyon işlemi, bir numuneden nükleik asitleri izole eder ve bunları, sonraki uygulamaları etkileyebilecek seyrelticiler ve kirletici maddeler içermeyen konsantre bir eluat formunda verir.
Nükleik Asit Ekstraksiyon Uygulamaları
Saflaştırılmış nükleik asitler, birçok farklı endüstriye yayılan çok sayıda farklı uygulamada kullanılmaktadır. Pek çok farklı test amacı için saflaştırılmış RNA ve DNA'nın gerekli olduğu sağlık hizmetleri belki de en çok kullanıldığı alandır.
Sağlık hizmetlerinde nükleik asit ekstraksiyonunun uygulamaları şunları içerir:
- Yeni Nesil Dizileme (NGS)
- Amplifikasyona dayalı SNP Genotiplemesi
- Dizi Tabanlı Genotipleme
- Kısıtlama Enzim Sindirimi
- Modifiye Edici Enzimler kullanılarak yapılan analizler (örn. Ligasyon ve Klonlama)
Sağlık hizmetlerinin ötesinde, babalık testi, adli tıp ve genom bilimi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere nükleik asit ekstraksiyonunun kullanıldığı başka alanlar da vardır.
Nükleik Asit Ekstraksiyonunun Kısa Tarihi
DNA ekstraksiyonuBilinen ilk izolasyonun 1869'da Friedrich Miescher adlı İsviçreli bir doktor tarafından gerçekleştirilmesine kadar uzanan bir geçmişe sahiptir. Miescher, hücrelerin kimyasal bileşimini belirleyerek yaşamın temel ilkelerini çözmeyi umuyordu. Lenfositlerle başarısız olduktan sonra, atılan bandajlardaki irin içinde bulunan lökositlerden ham bir DNA çökeltisi elde etmeyi başardı. Bunu, hücrenin sitoplazmasını terk edecek şekilde hücreye asit ve ardından alkali ekleyerek yaptı ve ardından DNA'yı diğer proteinlerden ayırmak için bir protokol geliştirdi.
Miescher'in çığır açan araştırmasını takiben, diğer birçok bilim insanı DNA'yı izole etmek ve saflaştırmak için ilerlemeye ve teknikler geliştirmeye devam etti. Bir protein bilimcisi olan Edwin Joseph Cohn, 2. Dünya Savaşı sırasında protein saflaştırması için birçok teknik geliştirdi. Kan damarlarındaki ozmotik basıncın korunmasında önemli olan kan plazmasının serum albümin fraksiyonunun izole edilmesinden sorumluydu. Bu, askerlerin hayatta kalması açısından çok önemliydi.
1953'te Francis Crick, Rosalind Franklin ve James Watson ile birlikte DNA'nın yapısını belirledi ve DNA'nın iki uzun nükleik asit nükleotid zincirinden oluştuğunu gösterdi. Bu çığır açıcı keşif, 1958 deneyleri sırasında DNA'nın yarı koruyucu replikasyonunu göstererek, E. Coli bakterilerinden DNA'yı izole etmek için bir yoğunluk gradyanlı santrifüjleme protokolü geliştirebilen Meselson ve Stahl'ın yolunu açtı.
Nükleik Asit Ekstraksiyon Teknikleri
DNA ekstraksiyonunun 4 aşaması nedir?
Tüm ekstraksiyon yöntemleri aynı temel adımlara dayanır.
Hücre Bozulması. Hücre lizizi olarak da bilinen bu aşama, ilgili nükleik asitleri içeren hücre içi sıvıların salınması için hücre duvarının ve/veya hücre zarının parçalanmasını içerir.
İstenmeyen Kalıntıların Temizlenmesi. Buna membran lipitleri, proteinler ve sonraki uygulamalara müdahale edebilecek diğer istenmeyen nükleik asitler dahildir.
İzolasyon. İlgilendiğiniz nükleik asitleri oluşturduğunuz temizlenmiş lizattan izole etmenin birkaç farklı yolu vardır ve bunlar iki ana kategoriye girer: çözelti bazlı veya katı hal (sonraki bölüme bakın).
Konsantrasyon. Nükleik asitler diğer tüm kirletici maddelerden ve seyrelticilerden izole edildikten sonra yüksek konsantrasyonlu bir eluat içinde sunulurlar.
İki Tür Ekstraksiyon
İki tür nükleik asit ekstraksiyonu vardır: çözelti bazlı yöntemler ve katı hal yöntemleri. Çözelti bazlı yöntem aynı zamanda kimyasal ekstraksiyon yöntemi olarak da bilinir, çünkü hücreyi parçalamak ve nükleik materyale erişmek için kimyasalların kullanılmasını içerir. Bu, fenol ve kloroform gibi organik bileşiklerin kullanılması veya Proteinaz K veya silika jel gibi daha az zararlı ve dolayısıyla daha fazla tavsiye edilen inorganik bileşiklerin kullanılması olabilir.
Bir hücreyi parçalamak için farklı kimyasal ekstraksiyon yöntemlerinin örnekleri şunları içerir:
- Membranın ozmotik yırtılması
- Hücre duvarının enzimatik sindirimi
- Membran çözünürlüğü
- Deterjanlı
- Alkali tedavisi ile
Mekanik yöntemler olarak da bilinen katı hal teknikleri, DNA'nın katı bir substratla nasıl etkileşime girdiğinin anlaşılmasını içerir. DNA'nın bağlanacağı ancak analitin bağlanmayacağı bir boncuk veya molekül seçilerek ikisini ayırmak mümkündür. Silika ve manyetik boncukların kullanılmasını içeren katı faz ekstraksiyon tekniklerine örnekler.
Manyetik Boncuk Çıkarma Açıklaması
Manyetik Boncuk Çıkarma Yöntemi
Manyetik boncuklar kullanarak ekstraksiyon potansiyeli ilk kez Trevor Hawkins tarafından Whitehead Enstitüsü araştırma kurumu için sunulan bir ABD patentinde fark edildi. Bu patent, genetik materyali manyetik bir boncuk olabilecek katı bir destek taşıyıcısına bağlayarak çıkarmanın mümkün olduğunu kabul ediyordu. Prensip, genetik materyalin bağlanacağı son derece işlevselleştirilmiş bir manyetik boncuk kullanmanızdır; bu boncuk daha sonra numuneyi tutan kabın dışına manyetik bir kuvvet uygulanarak süpernatandan ayrılabilir.
Neden Manyetik Boncuk Çıkarma Kullanılmalı?
Hızlı ve etkili ekstraksiyon prosedürlerine yönelik potansiyeli nedeniyle manyetik boncuk ekstraksiyon teknolojisi giderek yaygınlaşmaktadır. Son zamanlarda, nükleik asit ekstraksiyonunun otomasyonunu ve kaynak açısından çok hafif ve uygun maliyetli bir iş akışını mümkün kılan, uygun tampon sistemlerine sahip yüksek düzeyde işlevselleştirilmiş manyetik boncuklarda gelişmeler olmuştur. Ayrıca, manyetik boncuk ekstraksiyon yöntemleri, daha uzun DNA parçalarını parçalayan kesme kuvvetlerine neden olabilecek santrifüjleme adımlarını içermez. Bu, genomik testlerde önemli olan daha uzun DNA iplikçiklerinin sağlam kaldığı anlamına gelir.
Gönderim zamanı: 25 Kasım 2022