giriiş
Nükleik asit ekstraksiyonu nedir?
En basit terimlerle, nükleik asit ekstraksiyonu, RNA ve/veya DNA'nın bir numuneden çıkarılması ve gerekli olmayan tüm fazlalıktır. Ekstraksiyon işlemi, nükleik asitleri bir numuneden izole eder ve bunları herhangi bir aşağı akış uygulamalarını etkileyebilecek seyrek ve kirletici maddelerden arınmış konsantre bir elüat şeklinde verir.
Nükleik asit ekstraksiyonunun uygulamaları
Saflaştırılmış nükleik asitler, birden fazla farklı endüstri arasında değişen çok sayıda farklı uygulamada kullanılır. Sağlık hizmetleri, belki de en çok kullanıldığı alandır, farklı test amacıyla farklı bir dizi için saflaştırılmış RNA ve DNA ile gereklidir.
Sağlık hizmetlerinde nükleik asit ekstraksiyonunun uygulamaları şunlardır:
- Yeni Nesil Sekanslama (NGS)
- Amplifikasyon tabanlı SNP genotipleme
- Dizi tabanlı genotipleme
- Kısıtlama enzimi sindirimi
- Değiştirme enzimlerini kullanarak analizler (örneğin ligasyon ve klonlama)
Babalık testi, adli tıp ve genomikler dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, nükleik asit ekstraksiyonunun kullanıldığı sağlık hizmetlerinin ötesinde başka alanlar da vardır.
Nükleik asit ekstraksiyonunun kısa bir geçmişi
DNA ekstraksiyonu1869'da Friedrich Miescher adlı bir İsviçre doktoru tarafından gerçekleştirilen ilk bilinen izolasyon ile uzun bir yolla kalıyor. Miescher, hücrelerin kimyasal bileşimini belirleyerek yaşamın temel ilkelerini çözmeyi umuyordu. Lenfositlerle başarısız olduktan sonra, atılan bandajlarda irin içinde bulunan lökositlerden kaba bir DNA çökeltisi elde edebildi. Bunu hücrenin sitoplazmasını terk etmek için hücreye asit ve sonra alkali ekleyerek yaptı ve daha sonra DNA'yı diğer proteinlerden ayırmak için bir protokol geliştirdi.
Miescher'ın çığır açan araştırmalarının ardından, diğer birçok bilim adamı DNA'yı izole etmek ve saflaştırmak için teknikleri geliştirmeye ve geliştirmeye devam etti. Bir protein bilimcisi Edwin Joseph Cohn, WW2 sırasında protein saflaştırması için birçok teknik geliştirdi. Kan damarlarındaki ozmotik basıncın korunmasında önemli olan kan plazmasının serum albümin fraksiyonunu izole etmekten sorumluydu. Bu askerleri canlı tutmak için çok önemliydi.
1953'te Francis Crick, Rosalind Franklin ve James Watson ile birlikte, DNA'nın yapısını belirledi ve bunun nükleik asit nükleotitlerinin uzun zincirlerinden oluştuğunu gösterdi. Bu atılım keşfi, 1958 deneyleri sırasında DNA'nın yarı muhafazakar replikasyonunu gösterdikleri için DNA'yı E. coli bakterilerinden izole etmek için yoğunluklu gradyan santrifüjleme protokolü geliştirebilen Meselson ve Stahl için yol açtı.
Nükleik asit ekstraksiyonu teknikleri
DNA ekstraksiyonunun 4 aşaması nelerdir?
Tüm ekstraksiyon yöntemleri aynı temel adımlara kadar kaynar.
Hücre bozulması. Hücre lizisi olarak da bilinen bu aşama, ilgili nükleik asitleri içeren hücre içi sıvıları salgılamak için hücre duvarını ve/veya hücre zarını parçalamayı içerir.
İstenmeyen kalıntıların çıkarılması. Bu, akış aşağı uygulamalarına müdahale edebilen membran lipitleri, proteinler ve diğer istenmeyen nükleik asitleri içerir.
İzolasyon. İlgilenilen nükleik asitleri, oluşturduğunuz temizlenmiş lizattan izole etmenin bir dizi farklı yolu vardır, bu da iki ana kategori arasına girer: çözüm tabanlı veya katı durum (bir sonraki bölüme bakınız).
Konsantrasyon. Nükleik asitler diğer tüm kirletici maddelerden ve seyreltilerden izole edildikten sonra, yüksek konsantre bir elüde içinde sunulur.
İki tür çıkarma
İki tip nükleik asit ekstraksiyonu vardır - çözelti tabanlı yöntemler ve katı hal yöntemleri. Çözelti tabanlı yöntem, hücreyi parçalamak ve nükleik malzemeye erişmek için kimyasalların kullanılmasını içerdiği için kimyasal ekstraksiyon yöntemi olarak da bilinir. Bu, ya fenol ve kloroform gibi organik bileşikler veya daha az zararlı ve dolayısıyla proteinaz K veya silika jel gibi daha fazla önerilen inorganik bileşikler kullanılabilir.
Bir hücreyi parçalamak için farklı kimyasal ekstraksiyon yöntemlerinin örnekleri şunlardır:
- Membranın ozmotik yırtılması
- Hücre duvarının enzimatik sindirimi
- Membranın çözülmesi
- Deterjanlarla
- Alkali tedavisi ile
Mekanik yöntemler olarak da bilinen katı hal teknikleri, DNA'nın katı bir substratla nasıl etkileşime girdiğini kullanmayı içerir. DNA'nın bağlanacağı ancak analitin bağlanacağı bir boncuk veya molekül seçerek, ikisini ayırmak mümkündür. Silika ve manyetik boncukları kullanma dahil olmak üzere katı faz ekstraksiyon tekniklerinin örnekleri.
Manyetik boncuk ekstraksiyonu açıklandı
Manyetik boncuk ekstraksiyon yöntemi
Manyetik boncuklar kullanılarak ekstraksiyon potansiyeli ilk olarak Whitehead Enstitüsü araştırma kurumu için Trevor Hawkins tarafından açılan bir ABD patentinde tanınmıştır. Bu patent, genetik materyali manyetik bir boncuk olabilecek katı bir destek taşıyıcıya bağlayarak çıkarmanın mümkün olduğunu kabul etti. Prensip, genetik materyalin bağlanacağı, daha sonra numuneyi tutan geminin dışına manyetik bir kuvvet uygulanarak süpernatandan ayrılabilen oldukça fonksiyonelleştirilmiş bir manyetik boncuk kullanmanızdır.
Neden manyetik boncuk ekstraksiyonu kullanıyor?
Manyetik boncuk ekstraksiyon teknolojisi, hızlı ve verimli ekstraksiyon prosedürleri için sahip olduğu potansiyel nedeniyle giderek yaygınlaşıyor. Son zamanlarda, nükleik asit ekstraksiyonunun ve çok kaynak ışığı ve uygun maliyetli olan bir iş akışının otomasyonunu mümkün kılan uygun tampon sistemleri olan yüksek işlevselleştirilmiş manyetik boncukların gelişmeleri olmuştur. Ayrıca, manyetik boncuk ekstraksiyon yöntemleri, daha uzun DNA parçalarını parçalayan kesme kuvvetlerine neden olabilecek santrifüj aşamalarını içermez. Bu, daha uzun DNA şeritlerinin sağlam kaldığı, bu da genomik testlerinde önemli olduğu anlamına gelir.
Gönderme Zamanı: Kasım-25-2022