Teoride şablonun bir molekülü yeterli olsa da, klasik bir PCR için tipik olarak çok daha büyük miktarlarda DNA kullanılır; örneğin, 1 µg'a kadar genomik memeli DNA'sı ve 1 pg kadar az plazmid DNA. Optimum miktar, büyük ölçüde hedef dizinin kopya sayısına ve karmaşıklığına bağlıdır.
Çok az kalıp kullanılırsa, yeterli miktarda ürün elde etmek için amplifikasyon döngülerinin sayısında buna karşılık gelen bir artışa ihtiyaç duyulacaktır. Çoğu PCR deneyinde kullanılan bir Taq polimerazı, bir düzeltme fonksiyonuna (3'-5' ekzonükleaz aktivitesi) sahip değildir; bu nedenle amplifikasyon sırasında meydana gelen hatalar düzeltilemez. Döngü sayısı ne kadar yüksek olursa, kusurlu ürünün amplifikasyonu da o kadar yaygın olacaktır. Öte yandan, şablon miktarı çok yüksekse, primer dimerlerinin oluşumunun yanı sıra diğer (yüzde yüz tamamlayıcı olmayan) dizilere bağlanma olasılığı da artacaktır ve bu da amplifikasyonla sonuçlanacaktır. yan ürünler. Çoğu durumda DNA, hücre kültürlerinden veya mikroorganizmalardan izole edilir ve daha sonra PCR şablonu olarak kullanılır. Saflaştırmanın ardından PCR kurulumu için gerekli hacmi tanımlayabilmek için DNA konsantrasyonunun belirlenmesi gerekir. Agaroz jel elektroforezi bir tahmin sağlamaya hizmet etse de, bu yöntem doğru olmaktan uzaktır. UV-Vis spektrofotometrisi, nükleik asitlerin miktarının belirlenmesinde altın standart olarak oluşturulmuştur; Bu doğrudan ve dolayısıyla kolay ve hızlı yöntem, numunenin 260 nm'deki absorbansını ölçer ve konsantrasyon, bir dönüşüm faktörü yardımıyla hesaplanır.
Ancak DNA konsantrasyonu çok düşükse (< 1 µg/mL dsDNA) veya 260 nm aralığında absorbe eden maddelerle (örn. RNA, protein, tuzlar) kirlenmişse bu yöntem sınırlamalarına ulaşacaktır. Çok düşük konsantrasyonlarda okumalar kısa sürede kullanılamayacak kadar hatalı hale gelecek ve kirlenmeler gerçek değerin (bazen çok büyük) fazla tahmin edilmesine yol açacaktır. Bu durumda floresans kullanılarak ölçüm bir alternatif sunabilir. Bu teknik, dsDNA'ya spesifik olarak bağlanan, yalnızca nükleik asit ve boya içeren kompleksin ışık tarafından uyarıldığı ve ardından biraz daha yüksek dalga boyunda ışık yayan bir floresan boyanın kullanımına dayanmaktadır. Burada floresan sinyalin yoğunluğu DNA miktarıyla orantılıdır ve konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğriye göre değerlendirilir. Bu yöntemin avantajları, kontaminasyondan kaynaklanan dış etkileri hariç tutan bağın özgüllüğüne ve bunun yanı sıra çok düşük DNA konsantrasyonlarını tespit etme yeteneğine dayanır. Her iki yöntemin de uygunluğu temel olarak numune konsantrasyonuna ve saflığına bağlıdır; Çoğu durumda her iki yöntemin paralel olarak uygulanması bile tavsiye edilebilir.
Gönderim zamanı: 30 Kasım 2022