Para sa matagumpay na mga reaksyon ng amplification, kinakailangan na ang mga indibidwal na sangkap ng reaksyon ay naroroon sa tamang konsentrasyon sa bawat paghahanda. Bilang karagdagan, mahalaga na walang kontaminasyong nangyayari.
Lalo na kapag maraming mga reaksyon ang kailangang i-set-up, ito ay itinatag upang maghanda ng isang tinatawag na master mix sa halip na i-pipet ang bawat reagent nang hiwalay sa bawat sisidlan. Ang mga paunang na-configure na mix ay available sa komersyo, kung saan ang mga bahagi lamang na partikular sa sample (primer) at tubig ang idinaragdag. Bilang kahalili, ang master mix ay maaaring ihanda ng iyong sarili. Sa parehong mga variant, ang timpla ay ipinamamahagi sa bawat PCR vessel nang walang template at ang indibidwal na sample ng DNA ay idinagdag nang hiwalay sa dulo.
Ang paggamit ng master mix ay may ilang mga pakinabang: Una, ang bilang ng mga solong hakbang sa pipetting ay nabawasan. Sa ganitong paraan, ang parehong panganib ng mga error ng user sa panahon ng pipetting at ang panganib ng kontaminasyon ay mababawasan at, siyempre, ang oras ay nai-save. Sa prinsipyo, ang katumpakan ng pipetting ay mas mataas din, dahil ang mas malalaking volume ay dosed. Madaling maunawaan ito kapag sinusuri ang teknikal na data ng mga pipette: Kung mas maliit ang dosed volume, mas mataas ang mga deviations . Ang katotohanan na ang lahat ng mga paghahanda ay nagmula sa parehong sisidlan ay may positibong epekto sa homogeneity (kung mahusay na halo-halong). Pinapabuti din nito ang reproducibility ng mga eksperimento.
Kapag naghahanda ng master mix, hindi bababa sa 10 % na dagdag na volume ang dapat idagdag (hal. kung 10 paghahanda ang kailangan, kalkulahin sa batayan ng 11), upang maging ang huling sisidlan ay mapuno ng maayos. Sa ganitong paraan, ang (slight) na mga kamalian sa pipetting, at ang epekto ng pagkawala ng sample kapag nagdo-dose ng mga solusyon na naglalaman ng detergent ay maaaring mabayaran. Ang mga detergent ay nakapaloob sa mga solusyon ng enzyme tulad ng mga polymerases at master mix, na nagiging sanhi ng pagbuo ng foam at mga nalalabi sa panloob na ibabaw ng normal.mga tip sa pipette.
Depende sa aplikasyon at uri ng likidong ibibigay, ang tamang pamamaraan ng pipetting (1) ay dapat piliin at piliin ang naaangkop na kagamitan. Para sa mga solusyon na naglalaman ng mga detergent, isang direktang sistema ng paglilipat o ang tinatawag na "mababang pagpapanatili" na mga tip sa pipette bilang alternatibo para sa mga air-cushion pipette ay inirerekomenda. Ang epekto ngTip sa ACE PIPETTEay batay sa isang partikular na hydrophobic na ibabaw. Ang mga likidong naglalaman ng mga detergent ay hindi nag-iiwan ng nalalabi na pelikula sa loob at labas, upang mabawasan ang pagkawala ng solusyon.
Bukod sa eksaktong dosing ng lahat ng mga sangkap, mahalaga din na walang kontaminasyon ng mga paghahanda na nangyayari. Hindi sapat na gumamit ng mga consumable na may mataas na kadalisayan, dahil ang proseso ng pipetting sa isang air cushion pipette ay maaaring makagawa ng mga aerosol na nananatili sa pipette. Ang DNA na maaaring nasa aerosol ay maaaring ilipat mula sa isang sample patungo sa susunod sa susunod na hakbang sa pipetting at sa gayon ay humantong sa kontaminasyon. Ang mga direktang displacement system na binanggit sa itaas ay maaari ring mabawasan ang panganib na ito. Para sa mga pipette ng air-cushion, makatuwirang gumamit ng mga tip sa filter upang protektahan ang pipette cone sa pamamagitan ng pagpapanatili ng mga splashes, aerosol, at biomolecules.
Oras ng post: Dis-06-2022