Para sa matagumpay na reaksyon ng pagpapalakas, kinakailangan na ang mga indibidwal na sangkap ng reaksyon ay naroroon sa tamang konsentrasyon sa bawat paghahanda. Bilang karagdagan, mahalaga na walang kontaminasyon na nangyayari.
Lalo na kung maraming mga reaksyon ang kailangang mai-set-up, naitatag ito upang maghanda ng isang tinatawag na master mix sa halip na i-pipetting ang bawat reagent nang hiwalay sa bawat sisidlan. Ang mga pre-configure na halo ay magagamit sa komersyo, kung saan ang mga sample na tiyak na sangkap (panimulang aklat) at tubig ay idinagdag. Bilang kahalili, ang master mix ay maaaring ihanda ng iyong sarili. Sa parehong mga variant, ang halo ay ipinamamahagi sa bawat daluyan ng PCR na walang template at ang indibidwal na sample ng DNA ay idinagdag nang hiwalay sa dulo.
Ang paggamit ng isang master mix ay may maraming mga pakinabang: una, ang bilang ng mga solong hakbang sa pipetting ay nabawasan. Sa ganitong paraan, kapwa ang panganib ng mga error sa gumagamit sa panahon ng pipetting at ang panganib ng kontaminasyon ay nabawasan at, siyempre, ang oras ay nai -save. Sa prinsipyo, ang kawastuhan ng pipetting ay mas mataas din, dahil ang mas malaking volume ay dosed. Madali itong maunawaan kapag sinusuri ang mga teknikal na data ng mga pipette: mas maliit ang dosed volume, mas mataas ang mga paglihis. Ang katotohanan na ang lahat ng mga paghahanda ay nagmula sa parehong daluyan ay may positibong epekto sa homogeneity (kung mahusay na halo -halong). Pinapabuti nito ang muling paggawa ng mga eksperimento.
Kapag inihahanda ang master mix, hindi bababa sa 10 % dagdag na dami ay dapat na maidagdag (hal. Kung kinakailangan ang 10 paghahanda, kalkulahin sa batayan ng 11), upang kahit na ang huling daluyan ay napuno nang maayos. Sa ganitong paraan, (bahagyang) mga kawastuhan ng pipetting, at ang epekto ng pagkawala ng sample kapag ang mga dosing detergent na naglalaman ng mga solusyon ay maaaring mabayaran. Ang mga detergents ay nakapaloob sa mga solusyon sa enzyme tulad ng mga polymerases at master mix, na nagiging sanhi ng pagbuo ng bula at mga nalalabi sa panloob na ibabaw ng normalMga tip sa pipette.
Depende sa application at ang uri ng likido na ma -dispense, ang tamang pamamaraan ng pipetting (1) ay dapat mapili at napili ang naaangkop na kagamitan. Para sa mga solusyon na naglalaman ng mga detergents, isang direktang sistema ng pag-aalis o ang tinatawag na "mababang pagpapanatili" na mga tip sa pipette bilang isang alternatibo para sa mga air-cushion pipette ay inirerekomenda. Ang epekto ngAce pipette tipay batay sa isang partikular na hydrophobic na ibabaw. Ang mga likido na naglalaman ng mga detergents ay hindi nag -iiwan ng isang nalalabi na pelikula sa loob at labas, upang ang pagkawala ng solusyon ay maaaring mabawasan.
Bukod sa eksaktong dosis ng lahat ng mga sangkap, mahalaga din na walang kontaminasyon sa mga paghahanda na nangyayari. Hindi sapat na gumamit ng mga consumable ng mataas na kadalisayan, dahil ang proseso ng pipetting sa isang air cushion pipette ay maaaring makagawa ng mga aerosol na nananatili sa pipette. Ang DNA na maaaring nakapaloob sa aerosol ay maaaring ilipat mula sa isang sample hanggang sa susunod sa sumusunod na hakbang na pipetting at sa gayon ay humantong sa kontaminasyon. Ang mga direktang sistema ng pag -aalis na nabanggit sa itaas ay maaari ring mabawasan ang panganib na ito. Para sa mga air-cushion pipette ay may katuturan na gumamit ng mga tip sa filter upang maprotektahan ang pipette cone sa pamamagitan ng pagpapanatili ng mga splashes, aerosol, at biomolecules.
Oras ng Mag-post: DEC-06-2022