Panimula
Ano ang Nucleic Acid Extraction?
Sa pinakasimpleng termino, ang pagkuha ng nucleic acid ay ang pagtanggal ng RNA at/o DNA mula sa isang sample at lahat ng labis na hindi kinakailangan. Ang proseso ng pagkuha ay naghihiwalay ng mga nucleic acid mula sa isang sample at nagbubunga ng mga ito sa anyo ng isang concentrated eluate, walang mga diluents at contaminants na maaaring makaapekto sa anumang mga downstream na aplikasyon.
Mga Aplikasyon ng Nucleic Acid Extraction
Ang mga purified nucleic acid ay ginagamit sa napakaraming iba't ibang mga aplikasyon, na sumasaklaw sa maraming iba't ibang industriya. Ang pangangalagang pangkalusugan ay marahil ang lugar kung saan ito madalas na ginagamit, na may purified RNA at DNA na kinakailangan para sa iba't ibang mga layunin ng pagsubok.
Ang mga aplikasyon ng pagkuha ng nucleic acid sa pangangalagang pangkalusugan ay kinabibilangan ng:
- Next Generation Sequencing (NGS)
- SNP Genotyping na nakabatay sa amplification
- Array-based Genotyping
- Restriction Enzyme Digestion
- Pagsusuri gamit ang Modifying Enzymes (eg Ligation at Cloning)
Mayroon ding iba pang mga larangan na lampas sa pangangalagang pangkalusugan kung saan ginagamit ang pagkuha ng nucleic acid, kabilang ngunit hindi limitado sa paternity testing, forensics at genomics.
Isang Maikling Kasaysayan ng Pagkuha ng Nucleic Acid
Pagkuha ng DNAMalayo na ang petsa, na ang unang kilalang paghihiwalay ay ginawa ng isang Swiss na manggagamot na nagngangalang Friedrich Miescher noong 1869. Umaasa si Miescher na malutas ang mga pangunahing prinsipyo ng buhay sa pamamagitan ng pagtukoy sa kemikal na komposisyon ng mga selula. Matapos mabigo sa mga lymphocytes, nakuha niya ang isang krudo na precipitate ng DNA mula sa mga leucocyte na natagpuan sa nana sa mga itinapon na benda. Ginawa niya ito sa pamamagitan ng pagdaragdag ng acid at pagkatapos ay alkali sa cell upang umalis sa cytoplasm ng cell, at pagkatapos ay bumuo ng isang protocol upang paghiwalayin ang DNA mula sa iba pang mga protina.
Kasunod ng ground-breaking na pananaliksik ni Miescher, maraming iba pang siyentipiko ang nagpatuloy at bumuo ng mga diskarte upang ihiwalay at linisin ang DNA. Si Edwin Joseph Cohn, isang siyentipikong protina ay nakabuo ng maraming pamamaraan para sa paglilinis ng protina noong WW2. Siya ang may pananagutan sa paghihiwalay ng serum albumin na bahagi ng plasma ng dugo, na mahalaga sa pagpapanatili ng osmotic pressure sa mga daluyan ng dugo. Ito ay napakahalaga para sa pagpapanatiling buhay ng mga sundalo.
Noong 1953, tinukoy ni Francis Crick, kasama sina Rosalind Franklin at James Watson, ang istruktura ng DNA, na nagpapakita na ito ay binubuo ng dalawang hibla ng mahabang kadena ng nucleic acid nucleotides. Ang pambihirang pagtuklas na ito ay nagbigay daan para kay Meselson at Stahl, na nakabuo ng isang density gradient centrifugation protocol upang ihiwalay ang DNA mula sa E. Coli bacteria habang ipinakita nila ang semi-konserbatibong pagtitiklop ng DNA sa kanilang 1958 na eksperimento.
Mga Teknik ng Nucleic Acid Extraction
Ano ang 4 na yugto ng pagkuha ng DNA?
Ang lahat ng mga paraan ng pagkuha ay kumukulo sa parehong mga pangunahing hakbang.
Pagkagambala ng Cell. Ang yugtong ito, na kilala rin bilang cell lysis, ay nagsasangkot ng pagsira sa cell wall at/o sa cell membrane, upang mailabas ang mga intra-cellular fluid na naglalaman ng mga nucleic acid na kinaiinteresan.
Pag-alis ng mga Hindi Ginustong Debris. Kabilang dito ang mga lipid ng lamad, protina at iba pang mga hindi gustong nucleic acid na maaaring makagambala sa mga aplikasyon sa ibaba ng agos.
Isolation. Mayroong ilang iba't ibang paraan upang ihiwalay ang mga nucleic acid na kinaiinteresan mula sa na-clear na lysate na iyong nilikha, na nasa pagitan ng dalawang pangunahing kategorya: batay sa solusyon o solidong estado (tingnan ang susunod na seksyon).
Konsentrasyon. Matapos mahiwalay ang mga nucleic acid mula sa lahat ng iba pang mga contaminant at diluent, ang mga ito ay iniharap sa isang highly-concentrated eluate.
Ang Dalawang Uri ng Extraction
Mayroong dalawang uri ng pagkuha ng nucleic acid – mga pamamaraan batay sa solusyon at mga pamamaraan ng solid state. Ang pamamaraang nakabatay sa solusyon ay kilala rin bilang paraan ng pagkuha ng kemikal, dahil kinabibilangan ito ng paggamit ng mga kemikal upang sirain ang selula at ma-access ang nucleic na materyal. Ito ay maaaring gamit ang alinman sa mga organikong compound gaya ng phenol at chloroform, o ang hindi gaanong nakakapinsala at samakatuwid ay mas inirerekomendang mga inorganic na compound gaya ng Proteinase K o silica gel.
Kasama sa mga halimbawa ng iba't ibang paraan ng pagkuha ng kemikal upang masira ang isang cell:
- Osmotic rupture ng lamad
- Enzymatic digestion ng cell wall
- Solubilisasyon ng lamad
- May mga detergent
- Sa paggamot ng alkali
Ang mga diskarte sa solid state, na kilala rin bilang mga mekanikal na pamamaraan, ay nagsasangkot ng pagsasamantala kung paano nakikipag-ugnayan ang DNA sa isang solidong substrate. Sa pamamagitan ng pagpili ng butil o molekula kung saan ang DNA ay magbibigkis ngunit ang analyte ay hindi, posibleng paghiwalayin ang dalawa. Mga halimbawa ng solid-phase extraction techniques kabilang ang paggamit ng silica at magnetic beads.
Ipinaliwanag ang Magnetic Bead Extraction
Ang Paraan ng Magnetic Bead Extraction
Ang potensyal para sa pagkuha gamit ang magnetic beads ay unang nakilala sa isang patent ng US na inihain ni Trevor Hawkins, para sa institusyong pananaliksik ng Whitehead Institute. Kinilala ng patent na ito na posibleng kunin ang genetic na materyal sa pamamagitan ng pagbubuklod sa mga ito sa isang solidong carrier ng suporta, na maaaring isang magnetic bead. Ang prinsipyo ay ang paggamit mo ng isang napaka-functionalized na magnetic bead kung saan ang genetic na materyal ay magbibigkis, na pagkatapos ay maaaring ihiwalay mula sa supernatant sa pamamagitan ng paglalapat ng magnetic force sa labas ng sisidlan na may hawak ng sample.
Bakit Gumamit ng Magnetic Bead Extraction?
Ang teknolohiya ng magnetic bead extraction ay nagiging laganap, dahil sa potensyal na taglay nito para sa mabilis at mahusay na mga pamamaraan ng pagkuha. Sa mga nagdaang panahon, nagkaroon ng mga pag-unlad ng mataas na functionalized na magnetic beads na may angkop na mga buffer system, na nagdulot ng posibleng pag-automate ng nucleic acid extraction at isang daloy ng trabaho na napakagaan ng mapagkukunan at matipid sa gastos. Gayundin, ang mga pamamaraan ng magnetic bead extraction ay hindi nagsasangkot ng mga centrifugation na hakbang na maaaring magdulot ng mga puwersa ng paggugupit na pumuputol ng mas mahabang piraso ng DNA. Nangangahulugan ito na ang mas mahabang mga hibla ng DNA ay nananatiling buo, na mahalaga sa pagsusuri ng genomics.
Oras ng post: Nob-25-2022