Kahit na sa teorya, ang isang molekula ng template ay magiging sapat, malaki ang halaga ng DNA ay karaniwang ginagamit para sa isang klasikong PCR, halimbawa, hanggang sa 1 µg ng genomic mammalian DNA at kasing liit ng 1 pg ng plasmid DNA. Ang pinakamainam na halaga ay nakasalalay sa higit sa bilang ng mga kopya ng pagkakasunud -sunod ng target, pati na rin sa pagiging kumplikado nito.
Kung ang napakaliit na template ay ginagamit, ang isang kaukulang pagtaas sa bilang ng mga siklo ng pagpapalakas ay kakailanganin upang makakuha ng isang sapat na halaga ng produkto. Ang isang taq polymerase na ginagamit para sa karamihan ng mga eksperimento sa PCR ay hindi nagtatampok ng isang pag-andar ng pagwawasto (3′-5 ′ exonuclease na aktibidad); Kaya, ang mga pagkakamali na nagaganap sa panahon ng pagpapalakas ay hindi maiwasto. Ang mas mataas na bilang ng mga siklo, mas laganap ang pagpapalakas ng flawed na produkto ay magiging. Kung, sa kabilang banda, ang halaga ng template ay masyadong mataas, ang posibilidad ng mga primer na nagsasama sa iba pang (hindi isang daang porsyento na komplimentaryong) mga pagkakasunud -sunod, pati na rin ang pagbuo ng mga primer dimer, ay tataas, na magreresulta sa pagpapalakas ng mga produkto. Sa maraming mga kaso, ang DNA ay nakahiwalay sa mga kultura ng cell o mula sa mga microorganism at kasunod na ginagamit bilang isang template ng PCR. Kasunod ng paglilinis, kinakailangan upang matukoy ang konsentrasyon ng DNA upang matukoy ang dami na kinakailangan para sa pag -setup ng PCR. Habang ang agarose gel electrophoresis ay maaaring maglingkod upang magbigay ng isang pagtatantya, ang pamamaraang ito ay malayo sa tumpak. Ang UV-vis spectrophotometry ay naitatag bilang pamantayang ginto para sa dami ng mga nucleic acid; Ang direkta at samakatuwid madali at mabilis na pamamaraan ay sumusukat sa pagsipsip ng sample sa 260 nm, at ang konsentrasyon ay kinakalkula sa tulong ng isang kadahilanan ng conversion.
Kung ang konsentrasyon ng DNA ay napakababa, gayunpaman (<1 µg/ml dsDNA), o kung nahawahan ito ng mga sangkap na sumisipsip din sa saklaw ng 260 nm (hal. RNA, protina, asing -gamot), ang pamamaraang ito ay maaabot ang mga limitasyon nito. Sa kaso ng napakababang konsentrasyon, ang mga pagbabasa ay malapit nang maging hindi tumpak upang magamit, at ang mga kontaminasyon ay hahantong sa (kung minsan ay napakalaking) overestimation ng aktwal na halaga. Sa kasong ito, ang dami gamit ang fluorescence ay maaaring magpakita ng isang kahalili. Ang pamamaraan na ito ay batay sa paggamit ng isang fluorescent dye na partikular na nagbubuklod sa dsDNA lamang ang kumplikadong binubuo ng nucleic acid at dye ay nasasabik sa ilaw, at pagkatapos ay maglabas ito ng ilaw ng isang bahagyang mas mataas na haba ng haba. Dito, ang intensity ng fluorescent signal ay proporsyonal sa dami ng DNA, at para sa pagtukoy ng konsentrasyon ay nasuri ito na may kaugnayan sa isang karaniwang curve. Ang mga bentahe ng pamamaraang ito ay nakasalalay sa pagiging tiyak ng bono, na hindi kasama ang mga panlabas na impluwensya na ipinakilala sa pamamagitan ng kontaminasyon, pati na rin sa nagresultang kakayahang makita ang napakababang konsentrasyon ng DNA. Ang pagiging angkop ng alinman sa pamamaraan ay nakasalalay higit sa lahat sa sample na konsentrasyon at kadalisayan; Sa maraming mga kaso maaari ring maipapayo na mag -aplay ng parehong mga pamamaraan na magkatulad.
Oras ng Mag-post: Nov-30-2022