PCR reaksiýamyza näçe şablon goşmaly?

Teoriýa boýunça, şablonyň bir molekulasy ýeterlik bolsa-da, has köp mukdarda DNK nusgawy PCR üçin ulanylýar, mysal üçin, 1 µg genom süýdemdiriji DNK we 1 pg plazmid DNK. Iň amatly mukdar, esasan, maksat yzygiderliliginiň nusgalarynyň sanyna we çylşyrymlylygyna baglydyr.

Örän az şablon ulanylsa, ýeterlik mukdarda önüm almak üçin güýçlendirme siklleriniň sanyny degişli köpeltmek zerur bolar. PCR synaglarynyň köpüsinde ulanylýan Taq polimeraza düzediş funksiýasy ýok (3′-5 ′ eksonukleýasiýa işjeňligi); şeýlelik bilen güýçlendirmek wagtynda ýüze çykýan ýalňyşlyklary düzedip bolmaz. Siklleriň sany näçe köp bolsa, kemçilikli önümiň güýçlendirilmegi şonça-da köp bolar. Beýleki bir tarapdan, şablonyň mukdary gaty köp bolsa, primerleriň beýleki (ýüz göterim öwgüli däl) yzygiderlilige birikmek ähtimallygy, şeýle hem başlangyç ölçegleriň emele gelmegi artar, bu bolsa güýçlenmegine getirer. önümler. Köp ýagdaýlarda DNK öýjük medeniýetlerinden ýa-da mikroorganizmlerden üzňeleşdirilýär we soňra PCR şablony hökmünde ulanylýar. Arassalanandan soň, PCR gurmak üçin zerur bolan göwrümi kesgitläp bilmek üçin DNK-nyň konsentrasiýasyny kesgitlemeli. Agarose gel elektroforezi, çaklamany üpjün edip bilýän bolsa-da, bu usul takyk däl. UV-Vis spektrofotometri, nuklein kislotalarynyň mukdary üçin altyn standart hökmünde döredildi; bu gönüden-göni we şonuň üçin aňsat we çalt usul 260 nm-de nusganyň siňdirilmegini ölçýär we konsentrasiýa öwrüliş faktorynyň kömegi bilen hasaplanýar.

DNK konsentrasiýasy gaty pes bolsa-da (<1 µg / mL dsDNA), ýa-da 260 nm aralykda (meselem, RNK, belok, duzlar) siňdirýän maddalar bilen hapalanan bolsa, bu usul çäklendirmelere ýeter. Örän pes konsentrasiýa bolan ýagdaýynda, okalýanlar tiz wagtdan ulanyp bolmajak derejede nädogry bolar we hapalanmalar hakyky bahanyň (käte ägirt) aşa baha berilmegine sebäp bolar. Bu ýagdaýda, floresan ulanyp kesgitlemek başga bir alternatiwa hödürläp biler. Bu usul, diňe dsDNA bilen baglanyşýan floresan boýagyň ulanylmagyna esaslanýar, diňe nuklein kislotasyndan we boýagdan ybarat toplum ýagtylyk bilen tolgundyrylýar we soňra birneme ýokary tolkun uzynlygynyň ýagtylygyny çykarar. Bu ýerde, floresan signalyň intensiwligi DNK mukdaryna proporsionaldyr we konsentrasiýany kesgitlemek üçin adaty egrä görä baha berilýär. Bu usulyň artykmaçlyklary, hapalanmak bilen ýüze çykýan daşarky täsirleri, şeýle hem DNK-nyň gaty pes konsentrasiýalaryny ýüze çykarmak ukybyna bagly bolmadyk baglanyşygyň aýratynlygyna baglydyr. Iki usulyň hem laýyklygy esasan nusga konsentrasiýasyna we arassalygyna baglydyr; köp halatlarda iki usuly hem paralel ulanmak maslahat berilýär.