ขวดไครโอเชียลโดยทั่วไปจะใช้สำหรับการจัดเก็บเซลล์ไลน์แบบแช่แข็งและวัสดุทางชีวภาพที่สำคัญอื่นๆ ใน dewars ที่เติมไนโตรเจนเหลว

มีหลายขั้นตอนที่เกี่ยวข้องในการเก็บรักษาเซลล์ในไนโตรเจนเหลวให้ประสบความสำเร็จ แม้ว่าหลักการพื้นฐานคือการแช่แข็งอย่างช้าๆ แต่เทคนิคที่แน่นอนที่ใช้นั้นขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์และสารป้องกันการแข็งตัวด้วยความเย็นที่ใช้ มีข้อควรพิจารณาด้านความปลอดภัยและแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดหลายประการที่ต้องคำนึงถึงเมื่อจัดเก็บเซลล์ที่อุณหภูมิต่ำเช่นนี้

โพสต์นี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อให้ภาพรวมเกี่ยวกับวิธีการจัดเก็บขวดสำหรับการแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว

Cryovials คืออะไร

ขวดสำหรับการแช่แข็งเป็นขวดขนาดเล็กที่มีฝาปิด ออกแบบมาเพื่อเก็บตัวอย่างของเหลวที่อุณหภูมิต่ำมาก ช่วยให้มั่นใจได้ว่าเซลล์ที่เก็บรักษาไว้ในไครโอโพรเทคแทนท์จะไม่สัมผัสโดยตรงกับไนโตรเจนเหลว ซึ่งช่วยลดความเสี่ยงของการแตกหักของเซลล์ในขณะที่ยังคงได้รับประโยชน์จากความเย็นที่รุนแรงของไนโตรเจนเหลว

โดยปกติขวดจะมีจำหน่ายหลายขนาดและหลายดีไซน์ โดยสามารถเกลียวในหรือต่อภายนอกโดยมีก้นแบนหรือกลมก็ได้ มีให้เลือกทั้งแบบปลอดเชื้อและไม่ฆ่าเชื้อ

ใครใช้ไซโรเวียลเพื่อเก็บเซลล์ไว้ในไนโตรเจนเหลว

ห้องปฏิบัติการ NHS และเอกชนหลายแห่ง รวมถึงสถาบันวิจัยที่เชี่ยวชาญด้านการธนาคารเลือดจากสายสะดือ ชีววิทยาของเซลล์เยื่อบุผิว วิทยาภูมิคุ้มกัน และชีววิทยาของเซลล์ต้นกำเนิด ใช้หลอดสำหรับการแช่แข็งเพื่อเก็บรักษาเซลล์ด้วยการแช่แข็ง

เซลล์ที่ถูกรักษาด้วยวิธีนี้รวมถึงเซลล์บีและที, เซลล์ CHO, เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดและเซลล์ต้นกำเนิด, ไฮบริโดมา, เซลล์ลำไส้, มาโครฟาจ, เซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมัลและเซลล์ต้นกำเนิด, มอนอไซต์, ไมอีโลมา, เซลล์ NK และเซลล์ต้นกำเนิดพลูริโพเทนต์

ภาพรวมของวิธีจัดเก็บขวดสำหรับการแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว

การเก็บรักษาด้วยการแช่แข็งเป็นกระบวนการที่ช่วยรักษาเซลล์และโครงสร้างทางชีวภาพอื่นๆ โดยการทำให้เซลล์และโครงสร้างทางชีวภาพอื่นๆ เย็นลงจนถึงอุณหภูมิที่ต่ำมาก เซลล์สามารถเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลวได้นานหลายปีโดยไม่สูญเสียความมีชีวิตของเซลล์ นี่คือโครงร่างของขั้นตอนการทำงาน

การเตรียมเซลล์

วิธีการที่แน่นอนในการเตรียมตัวอย่างจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับประเภทของเซลล์ แต่โดยทั่วไป เซลล์จะถูกรวบรวมและปั่นแยกเพื่อพัฒนาเป็นเม็ดที่มีเซลล์จำนวนมาก จากนั้นเม็ดนี้จะถูกแขวนลอยใหม่ในส่วนลอยเหนือตะกอนที่ผสมกับไครโอโพรเทคแทนท์หรือตัวกลางในการเก็บรักษาด้วยการแช่แข็ง

สื่อการเก็บรักษาด้วยการแช่แข็ง

ตัวกลางนี้ใช้เพื่อรักษาเซลล์ในสภาพแวดล้อมที่มีอุณหภูมิต่ำซึ่งเซลล์เหล่านั้นจะต้องเผชิญโดยการยับยั้งการก่อตัวของผลึกภายในและนอกเซลล์ และด้วยเหตุนี้เซลล์จึงตาย บทบาทของพวกเขาคือการจัดเตรียมสภาพแวดล้อมที่ปลอดภัยและปกป้องเซลล์และเนื้อเยื่อในระหว่างกระบวนการแช่แข็ง การจัดเก็บ และการละลาย

ตัวกลาง เช่น พลาสมาแช่แข็งสด (FFP) สารละลายพลาสมาไลต์เฮปาริไนซ์ หรือสารละลายปราศจากซีรั่ม ปราศจากส่วนประกอบของสัตว์ ผสมกับสารป้องกันความเย็นจัด เช่น ไดเมทิลซัลโฟไซด์ (DMSO) หรือกลีเซอรอล

เม็ดตัวอย่างที่ทำให้ของเหลวซ้ำจะถูกแบ่งส่วนลงในขวดสำหรับการแช่แข็งที่ทำจากโพลีโพรพีลีน เช่นบริษัท Suzhou Ace Biomedical บริษัท Cryogenic Storage Vials.

สิ่งสำคัญคือต้องไม่เติมขวดสำหรับการแช่แข็งมากเกินไป เนื่องจากจะเพิ่มความเสี่ยงของการแตกร้าวและสารที่อยู่ภายในอาจรั่วไหลออกมา (1)

อัตราการแช่แข็งที่ควบคุมได้

โดยทั่วไป อัตราการเยือกแข็งที่ควบคุมอย่างช้าๆ จะถูกนำมาใช้เพื่อความสำเร็จในการเก็บรักษาเซลล์ด้วยการแช่แข็ง

หลังจากแบ่งส่วนตัวอย่างลงในขวดไครโอเจนิกแล้ว ตัวอย่างจะถูกวางบนน้ำแข็งเปียกหรือในตู้เย็นที่มีอุณหภูมิ 4°C และขั้นตอนการแช่แข็งจะเริ่มขึ้นภายใน 5 นาที ตามแนวทางทั่วไป เซลล์จะถูกทำให้เย็นลงในอัตรา -1 ถึง -3 ต่อนาที (2) ซึ่งสามารถทำได้โดยใช้เครื่องทำความเย็นแบบตั้งโปรแกรมได้ หรือโดยการวางขวดลงในกล่องฉนวนที่วางไว้ในตู้แช่แข็งที่มีอัตรา –70°C ถึง –90°C

ถ่ายโอนไปยังไนโตรเจนเหลว

ขวดไครโอเจนิกแช่แข็งจะถูกถ่ายโอนไปยังถังไนโตรเจนเหลวเป็นระยะเวลาไม่แน่นอน โดยคงอุณหภูมิไว้ที่ต่ำกว่า -135°C

อุณหภูมิต่ำพิเศษเหล่านี้สามารถได้รับได้โดยการแช่ในไนโตรเจนที่เป็นของเหลวหรือไอ

เฟสของเหลวหรือไอ?

เป็นที่ทราบกันดีว่าการเก็บรักษาในไนโตรเจนเฟสของเหลวสามารถรักษาอุณหภูมิความเย็นให้คงตัวได้ แต่มักไม่แนะนำด้วยเหตุผลต่อไปนี้:

• ความต้องการไนโตรเจนเหลวในปริมาณมาก (ความลึก) ซึ่งอาจเป็นอันตรายได้ แผลไหม้หรือหายใจไม่ออกเนื่องจากสิ่งนี้ถือเป็นความเสี่ยงที่แท้จริง
• บันทึกกรณีการปนเปื้อนข้ามโดยสารติดเชื้อ เช่น แอสเปอร์จิลลัส ตับบี และการแพร่กระจายของไวรัสผ่านตัวกลางไนโตรเจนเหลว (2,3)
• โอกาสที่ไนโตรเจนเหลวจะรั่วลงในขวดระหว่างการแช่ เมื่อนำออกจากที่เก็บและอุ่นจนถึงอุณหภูมิห้อง ไนโตรเจนจะขยายตัวอย่างรวดเร็ว ผลที่ตามมาคือขวดอาจแตกเมื่อนำออกจากที่เก็บไนโตรเจนเหลว ก่อให้เกิดอันตรายจากทั้งเศษซากและการสัมผัสกับสาร (1, 4)

ด้วยเหตุผลเหล่านี้ การจัดเก็บที่อุณหภูมิต่ำเป็นพิเศษจึงมักอยู่ในไนโตรเจนเฟสไอ เมื่อต้องเก็บตัวอย่างในเฟสของเหลว ควรใช้ท่อไครโอเฟล็กซ์แบบพิเศษ

ข้อเสียของเฟสไอคือการไล่ระดับอุณหภูมิในแนวตั้งสามารถเกิดขึ้นได้ ส่งผลให้อุณหภูมิมีความผันผวนระหว่าง -135°C ถึง -190°C สิ่งนี้จำเป็นต้องมีการตรวจสอบระดับไนโตรเจนเหลวและความแปรผันของอุณหภูมิอย่างระมัดระวังและขยันขันแข็ง (5)

ผู้ผลิตหลายรายแนะนำว่าขวดสำหรับการแช่แข็งเหมาะสำหรับการเก็บรักษาที่มีอุณหภูมิต่ำถึง -135°C หรือใช้ในช่วงที่เป็นไอเท่านั้น

การละลายเซลล์ที่เก็บรักษาด้วยความเย็นจัดของคุณ

ขั้นตอนการละลายเป็นเรื่องที่เครียดสำหรับการเพาะเลี้ยงแบบแช่แข็ง และจำเป็นต้องมีการจัดการและเทคนิคที่เหมาะสมเพื่อให้มั่นใจถึงความมีชีวิต การฟื้นตัว และการทำงานของเซลล์อย่างเหมาะสม แนวทางการละลายที่แน่นอนจะขึ้นอยู่กับประเภทเซลล์เฉพาะ อย่างไรก็ตาม การละลายอย่างรวดเร็วถือเป็นมาตรฐานสำหรับ:

• ลดผลกระทบต่อการฟื้นตัวของเซลล์
• ช่วยลดเวลาการสัมผัสกับตัวถูกละลายที่อยู่ในตัวกลางเยือกแข็ง
• ลดความเสียหายใดๆ จากการตกผลึกด้วยน้ำแข็ง

อ่างน้ำ อ่างเม็ดบีด หรือเครื่องมืออัตโนมัติเฉพาะทางมักใช้ในการละลายตัวอย่าง

โดยส่วนใหญ่ ละลายเซลล์ไลน์ 1 เส้นครั้งละ 1-2 นาที โดยหมุนเบาๆ ในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิ 37°C จนกระทั่งเหลือน้ำแข็งเล็กน้อยในขวดก่อนนำไปล้างในอาหารเลี้ยงเชื้อที่อุ่นไว้ล่วงหน้า

สำหรับเซลล์บางชนิด เช่น เอ็มบริโอของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การอุ่นอย่างช้าๆ ถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการอยู่รอดของพวกมัน

ขณะนี้เซลล์พร้อมสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ การแยกเซลล์ หรือในกรณีของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด – การศึกษาความมีชีวิตเพื่อรับประกันความสมบูรณ์ของเซลล์ต้นกำเนิดจากผู้บริจาคก่อนการบำบัดด้วยการทำลายเซลล์เม็ดเลือด

เป็นเรื่องปกติที่จะแบ่งส่วนเล็กๆ ของตัวอย่างที่ล้างไว้ล่วงหน้าซึ่งใช้ในการนับเซลล์เพื่อกำหนดความเข้มข้นของเซลล์สำหรับการชุบในการเพาะเลี้ยง จากนั้นคุณสามารถประเมินผลลัพธ์ของขั้นตอนการแยกเซลล์และพิจารณาความมีชีวิตของเซลล์ได้

แนวปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการจัดเก็บขวดสำหรับการแช่แข็ง

การเก็บรักษาตัวอย่างด้วยการแช่แข็งที่ประสบความสำเร็จในขวดสำหรับการแช่แข็งนั้นขึ้นอยู่กับองค์ประกอบหลายอย่างในเกณฑ์วิธี รวมถึงการจัดเก็บและการเก็บบันทึกที่เหมาะสม

• แยกเซลล์ระหว่างสถานที่จัดเก็บ– หากมีปริมาตรเพียงพอ ให้แยกเซลล์ระหว่างขวดต่างๆ และจัดเก็บไว้ในตำแหน่งที่แยกจากกัน เพื่อลดความเสี่ยงที่จะสูญเสียตัวอย่างเนื่องจากอุปกรณ์ขัดข้อง
• ป้องกันการปนเปื้อนข้าม– เลือกใช้ขวดแช่แข็งหรือหม้อนึ่งฆ่าเชื้อแบบใช้ครั้งเดียวก่อนใช้งานครั้งต่อไป
• ใช้ขวดขนาดที่เหมาะสมสำหรับเซลล์ของคุณ– ขวดมีขนาดตั้งแต่ 1 ถึง 5 มล. หลีกเลี่ยงการเติมขวดมากเกินไปเพื่อลดความเสี่ยงของการแตกร้าว
• เลือกขวดไครโอเจนิกแบบเกลียวภายในหรือภายนอก– มหาวิทยาลัยบางแห่งแนะนำให้ใช้ขวดเกลียวภายในสำหรับมาตรการด้านความปลอดภัย นอกจากนี้ยังสามารถป้องกันการปนเปื้อนระหว่างการบรรจุหรือเมื่อเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลว
• ป้องกันการรั่วไหล- ใช้ซีลแบบฉีดสองชั้นที่หล่อไว้ในฝาเกลียวหรือโอริงเพื่อป้องกันการรั่วและการปนเปื้อน
• ใช้บาร์โค้ด 2D และขวดฉลาก– เพื่อให้มั่นใจในการตรวจสอบย้อนกลับ ขวดที่มีพื้นที่การเขียนขนาดใหญ่ช่วยให้แต่ละขวดสามารถติดฉลากได้อย่างเพียงพอ บาร์โค้ด 2D สามารถช่วยในการจัดการพื้นที่จัดเก็บและการเก็บบันทึกได้ ตัวพิมพ์ใหญ่ที่มีรหัสสีมีประโยชน์ในการระบุตัวตนได้ง่ายขึ้น
• การบำรุงรักษาพื้นที่จัดเก็บอย่างเพียงพอ- เพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์จะไม่สูญหาย ภาชนะจัดเก็บควรตรวจสอบอุณหภูมิและระดับไนโตรเจนเหลวอย่างต่อเนื่อง ควรติดตั้งสัญญาณเตือนเพื่อแจ้งเตือนผู้ใช้ถึงข้อผิดพลาด

ข้อควรระวังด้านความปลอดภัย

ไนโตรเจนเหลวกลายเป็นเรื่องปกติในการวิจัยสมัยใหม่ แต่อาจเสี่ยงต่อการบาดเจ็บสาหัสหากใช้ไม่ถูกต้อง

ควรสวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE) ที่เหมาะสมเพื่อลดความเสี่ยงของการถูกความเย็นกัด แผลไหม้ และเหตุการณ์ไม่พึงประสงค์อื่น ๆ เมื่อจัดการกับไนโตรเจนเหลว สวมใส่

• ถุงมือไครโอเจนิกส์
• เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ
• ชิลด์หน้าแบบเต็มหน้าทนต่อแรงกระแทกและคลุมบริเวณคอด้วย
• รองเท้าหัวปิด
• ผ้ากันเปื้อนพลาสติกป้องกันน้ำกระเซ็น

ควรวางตู้เย็นไนโตรเจนเหลวในบริเวณที่มีการระบายอากาศดีเพื่อลดความเสี่ยงของภาวะขาดอากาศหายใจ เนื่องจากไนโตรเจนที่ระเหยออกมาจะระเหยกลายเป็นไอและแทนที่ออกซิเจนในบรรยากาศ ร้านค้าที่มีปริมาณมากควรมีระบบแจ้งเตือนออกซิเจนต่ำ

การทำงานเป็นคู่เมื่อต้องจัดการกับไนโตรเจนเหลวถือเป็นอุดมคติ และควรห้ามใช้นอกเวลาทำงานปกติ

ขวดสำหรับการแช่แข็งเพื่อรองรับขั้นตอนการทำงานของคุณ

บริษัท Suzhou Ace Biomedical นำเสนอผลิตภัณฑ์ที่หลากหลายซึ่งตรงกับความต้องการในการเก็บรักษาด้วยการแช่แข็งสำหรับเซลล์ประเภทต่างๆ กลุ่มผลิตภัณฑ์ประกอบด้วยกลุ่มผลิตภัณฑ์หลอดและหลอดสำหรับการแช่แข็งที่ผ่านการฆ่าเชื้อหลายรุ่น

ขวดสำหรับการแช่แข็งของเราคือ:

• ฝาเกลียวสำหรับห้องปฏิบัติการ 0.5mL 1.5mL 2.0mL Cryovial Cryogenic Vials Conical Bottom Cryotube พร้อมปะเก็น

  ● ข้อกำหนด 0.5ml, 1.5ml, 2.0ml มีกระโปรงหรือไม่มีกระโปรง
  ● มีทั้งแบบทรงกรวยหรือแบบตั้งพื้น มีทั้งแบบปลอดเชื้อหรือไม่ฆ่าเชื้อ
  ● ท่อฝาเกลียวทำจากโพลีโพรพีลีนเกรดทางการแพทย์
  ● ขวด PP Cryotube สามารถแช่แข็งและละลายซ้ำๆ ได้
  ●การออกแบบฝาปิดภายนอกสามารถลดความเป็นไปได้ในการปนเปื้อนในระหว่างการรักษาตัวอย่าง
  ● ท่อไครโอเจนิกแบบฝาเกลียว เกลียวอเนกประสงค์สำหรับใช้งาน
  ● ท่อต่างๆ พอดีกับโรเตอร์ทั่วไป
  ● ท่อโอริงท่อไครโอเจนิกส์พอดีกับกล่องแช่แข็งมาตรฐานขนาด 1 นิ้วและ 2 นิ้ว, 48 หลุม, 81 หลุม, 96 หลุมและ 100 หลุม
  ● หม้อนึ่งฆ่าเชื้อได้ที่อุณหภูมิ 121°C และแช่แข็งได้ถึง -86°C

  หมายเลขชิ้นส่วน	วัสดุ	ปริมาณ	หมวกแก๊ปสี	ชิ้น/ถุง	กระเป๋า/กล่อง
  ACT05-BL-N	PP	0.5มล	ดำ, เหลือง, น้ำเงิน, แดง, ม่วง, ขาว	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5มล	ดำ, เหลือง, น้ำเงิน, แดง, ม่วง, ขาว	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5มล	ดำ, เหลือง, น้ำเงิน, แดง, ม่วง, ขาว	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0มล	ดำ, เหลือง, น้ำเงิน, แดง, ม่วง, ขาว	500	10