เราควรเพิ่มเทมเพลตเท่าใดในปฏิกิริยา PCR ของฉัน

แม้ว่าตามทฤษฎีแล้ว หนึ่งโมเลกุลของเทมเพลตก็เพียงพอแล้ว แต่โดยปกติแล้ว DNA ในปริมาณที่มากกว่ามากมักจะใช้สำหรับ PCR แบบคลาสสิก ตัวอย่างเช่น DNA ของจีโนมของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมากถึง 1 ไมโครกรัม และพลาสมิด DNA เพียง 1 พิโกกรัม จำนวนที่เหมาะสมจะขึ้นอยู่กับจำนวนสำเนาของลำดับเป้าหมายเป็นส่วนใหญ่ รวมถึงความซับซ้อนด้วย

หากใช้เทมเพลตเพียงเล็กน้อย จะต้องเพิ่มจำนวนรอบการขยายสัญญาณตามลำดับเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ในปริมาณที่เพียงพอ Taq polymerase ที่ใช้สำหรับการทดลอง PCR ส่วนใหญ่ไม่มีฟังก์ชันการแก้ไข (กิจกรรม exonuclease 3′-5′); ดังนั้นข้อผิดพลาดที่เกิดขึ้นระหว่างการขยายจึงไม่สามารถแก้ไขได้ ยิ่งจำนวนรอบสูงเท่าใด การขยายของผลิตภัณฑ์ที่มีข้อบกพร่องก็จะยิ่งแพร่หลายมากขึ้นเท่านั้น ในทางกลับกัน หากปริมาณของเทมเพลตสูงเกินไป ความน่าจะเป็นที่ไพรเมอร์จะหลอมเข้ากับลำดับอื่นๆ (ไม่ใช่แบบอิสระหนึ่งร้อยเปอร์เซ็นต์) รวมถึงการก่อตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์ จะเพิ่มขึ้น ซึ่งจะส่งผลให้เกิดการขยายของ ผลพลอยได้ ในหลายกรณี DNA ถูกแยกออกจากการเพาะเลี้ยงเซลล์หรือจากจุลินทรีย์ และต่อมาใช้เป็นเทมเพลต PCR หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ จำเป็นต้องกำหนดความเข้มข้นของ DNA เพื่อให้สามารถกำหนดปริมาตรที่จำเป็นสำหรับการตั้งค่า PCR แม้ว่า agarose gel electrophoresis อาจช่วยประมาณค่าได้ แต่วิธีนี้ยังห่างไกลจากความแม่นยำ เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV-Vis ได้รับการจัดตั้งขึ้นเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการตรวจวัดปริมาณกรดนิวคลีอิก วิธีการโดยตรงที่ง่ายและรวดเร็วนี้วัดค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ 260 นาโนเมตร และความเข้มข้นจะคำนวณโดยใช้ปัจจัยการแปลง

อย่างไรก็ตาม หากความเข้มข้นของ DNA ต่ำมาก (< 1 µg/mL dsDNA) หรือหากปนเปื้อนด้วยสารที่ดูดซับในช่วง 260 นาโนเมตรด้วย (เช่น RNA โปรตีน เกลือ) วิธีการนี้จะถึงขีดจำกัด ในกรณีที่มีความเข้มข้นต่ำมาก การอ่านค่าจะไม่ถูกต้องเกินกว่าจะนำไปใช้ได้ในไม่ช้า และการปนเปื้อนจะนำไปสู่การประเมินค่าจริงสูงเกินไป (บางครั้งก็มหาศาล) ในกรณีนี้ การหาปริมาณโดยใช้สารเรืองแสงอาจเป็นอีกทางเลือกหนึ่ง เทคนิคนี้มีพื้นฐานมาจากการใช้สีย้อมฟลูออเรสเซนต์ที่จับกับ dsDNA โดยเฉพาะ สารเชิงซ้อนที่ประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกและสีย้อมจะถูกกระตุ้นด้วยแสง และจะปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่นสูงขึ้นเล็กน้อยในเวลาต่อมา ในที่นี้ ความเข้มของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเป็นสัดส่วนกับปริมาณของ DNA และในการกำหนดความเข้มข้นนั้นจะถูกประเมินโดยสัมพันธ์กับเส้นโค้งมาตรฐาน ข้อดีของวิธีนี้ขึ้นอยู่กับความจำเพาะของพันธะ โดยไม่รวมถึงอิทธิพลภายนอกที่เกิดจากการปนเปื้อน รวมถึงผลความสามารถในการตรวจจับความเข้มข้นของ DNA ที่ต่ำมาก ความเหมาะสมของวิธีใดวิธีหนึ่งขึ้นอยู่กับความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของตัวอย่างเป็นหลัก ในหลายกรณีอาจแนะนำให้ใช้ทั้งสองวิธีควบคู่กันไป