Муқаддима
Истеҳсоли кислотаи нуклеинӣ чист?
Дар соддатарин истилоҳҳо, истихроҷи кислотаи нуклеинӣ хориҷ кардани РНК ва/ё ДНК аз намуна ва ҳама зиёдатии зарурӣ нест. Раванди истихроҷ кислотаҳои нуклеинро аз намуна ҷудо мекунад ва онҳоро дар шакли элюати консентратсионӣ медиҳад, ки аз ҳалкунандаҳо ва ифлоскунандаҳо, ки метавонанд ба ҳама гуна замимаҳои поёноб таъсир расонанд.
Барномаҳои истихроҷи кислотаи нуклеинӣ
Кислотаҳои тозашудаи нуклеинӣ дар як қатор барномаҳои гуногун истифода мешаванд, ки дар бисёр соҳаҳои гуногун истифода мешаванд. Тандурустӣ шояд соҳае бошад, ки дар он бештар истифода мешавад ва РНК ва ДНК-и тозашуда барои як қатор мақсадҳои гуногуни санҷиш лозим аст.
Истифодаи истихроҷи кислотаи нуклеинӣ дар соҳаи тандурустӣ инҳоянд:
- пайдарпайии насли оянда (NGS)
- Генотипи SNP дар асоси амплификация
- Генотипизатсия дар асоси массив
- Маҳдудияти ҳозима ферментҳо
- Таҳлилҳо бо истифода аз ферментҳои тағирдиҳанда (масалан, Лигатсионӣ ва Клонсозӣ)
Ғайр аз соҳаи тандурустӣ, инчунин дигар соҳаҳо мавҷуданд, ки дар онҳо истихроҷи кислотаи нуклеин истифода мешавад, аз ҷумла, вале бо санҷиши падарӣ, криминалистика ва геномика.
Таърихи мухтасари истихроҷи кислотаи нуклеинӣ
истихроҷи ДНКТаърихи дуру дарозе дорад, ки аввалин ҷудокунии маълум аз ҷониби табиби швейтсарӣ бо номи Фридрих Мишер дар соли 1869 анҷом дода шудааст. Мишер умедвор буд, ки принсипҳои асосии ҳаётро тавассути муайян кардани таркиби химиявии ҳуҷайраҳо ҳал кунад. Пас аз нокомӣ бо лимфоситҳо, ӯ тавонист як преципити хоми ДНК-ро аз лейкоситҳое, ки дар чирк дар бинтҳои партофташуда ёфтанд, ба даст орад. Вай ин корро тавассути илова кардани кислота ва сипас сілтӣ ба ҳуҷайра барои тарк кардани ситоплазмаи ҳуҷайра анҷом дод ва сипас протоколи ҷудо кардани ДНК аз сафедаҳои дигарро таҳия кард.
Пас аз таҳқиқоти барҷастаи Мишер, бисёр олимони дигар ба пешрафт ва таҳияи усулҳои ҷудо кардан ва тоза кардани ДНК рафтанд. Эдвин Ҷозеф Кон, олими протеин дар давоми Ҷанги Дуюми Ҷаҳонӣ усулҳои зиёдеро барои тоза кардани сафеда таҳия кардааст. Вай барои ҷудо кардани фраксияи альбуминҳои хунобаи плазмаи хун масъул буд, ки барои нигоҳ доштани фишори осмотикӣ дар рагҳои хун муҳим аст. Ин барои зинда нигоҳ доштани сарбозон муҳим буд.
Соли 1953 Фрэнсис Крик ҳамроҳ бо Розалинд Франклин ва Ҷеймс Уотсон сохтори ДНК-ро муайян карда, нишон дод, ки он аз ду риштаи занҷири дарози нуклеотидҳои кислотаи нуклеинӣ иборат аст. Ин кашфи рахнашуда барои Меселсон ва Стаҳл роҳ кушод, ки онҳо тавонистанд протоколи градиентии центрифугакунии зичро барои ҷудо кардани ДНК аз бактерияҳои E. Coli таҳия кунанд, зеро онҳо дар давоми таҷрибаи соли 1958 такрори нимконсервативии ДНК-ро нишон доданд.
Усулҳои истихроҷи кислотаи нуклеинӣ
4 марҳилаи истихроҷи ДНК кадомҳоянд?
Ҳамаи усулҳои истихроҷ ба як қадамҳои бунёдӣ мерасанд.
Ихтилоли ҳуҷайра. Ин марҳила, ки бо номи лизиси ҳуҷайра низ маълум аст, шикастани девори ҳуҷайра ва / ё мембранаи ҳуҷайраро дар бар мегирад, то моеъҳои дохили ҳуҷайраро, ки кислотаҳои нуклеинҳои ҷолиб доранд, озод кунанд.
Бартараф кардани партовҳои номатлуб. Ба ин липидҳои мембрана, сафедаҳо ва дигар кислотаҳои нуклеинҳои номатлуб дохил мешаванд, ки метавонанд ба барномаҳои поёноб халал расонанд.
Ҷудогона будан. Якчанд роҳҳои гуногуни ҷудо кардани кислотаҳои нуклеини мавриди таваҷҷӯҳ аз лизати тозашудаи шумо мавҷуданд, ки ба байни ду категорияи асосӣ дохил мешаванд: дар асоси маҳлул ё ҳолати сахт (нигаред ба фасли оянда).
Консентратсияи. Пас аз он ки кислотаҳои нуклеинӣ аз ҳама ифлоскунандаҳо ва ҳалкунандаҳои дигар ҷудо карда шуданд, онҳо дар элюати консентратсияи баланд пешниҳод карда мешаванд.
Ду намуди истихроҷ
Ду намуди истихроҷи кислотаи нуклеинӣ вуҷуд дорад - усулҳои маҳлул ва усулҳои ҳолати сахт. Усули ба маҳлул асосёфта инчунин ҳамчун усули истихроҷи кимиёвӣ маълум аст, зеро он истифодаи кимиёвиро барои шикастани ҳуҷайра ва дастрасӣ ба маводи нуклеинӣ дар бар мегирад. Ин метавонад бо истифода аз пайвастагиҳои органикӣ, ба монанди фенол ва хлороформ, ё камтар зараровар ва аз ин рӯ пайвастагиҳои ғайриорганикӣ, ба монанди Proteinase K ё silicagel истифода шавад.
Намунаҳои усулҳои гуногуни истихроҷи кимиёвӣ барои шикастани ҳуҷайра иборатанд аз:
- шикастани осмотикии мембрана
- Ҳазми ферментативии девори ҳуҷайра
- ҳалшавандагии мембрана
- Бо маводи шустушӯй
- Бо табобати сілтӣ
Усулҳои ҳолати сахт, ки бо номи усулҳои механикӣ низ маълуманд, истифодаи истифодаи ДНК бо субстрати сахтро дар бар мегирад. Бо интихоби дандон ё молекулае, ки ДНК ба он мепайвандад, аммо аналит намехоҳад, ҳардуро ҷудо кардан мумкин аст. Намунаҳои усулҳои истихроҷи марҳилаи сахт, аз ҷумла истифодаи кремний ва маҳтобҳои магнитӣ.
Истихроҷи Bead магнитӣ Шарҳ
Усули истихроҷи магнитӣ
Потенсиали истихроҷ бо истифода аз маҳтобҳои магнитӣ бори аввал дар патенти ИМА аз ҷониби Тревор Ҳокинс барои муассисаи тадқиқотии Институти Уайтхед эътироф карда шуд. Ин патент эътироф кард, ки тавассути пайваст кардани онҳо ба як интиқолдиҳандаи сахт, ки метавонад як маҳтоби магнитӣ бошад, истихроҷи маводи генетикӣ имконпазир аст. Принсип ин аст, ки шумо як маҳтобаки магнитии хеле функсионалии онро истифода мебаред, ки ба он маводи генетикӣ мепайвандад, ки пас аз он тавассути истифодаи қувваи магнитӣ ба беруни зарфе, ки намунаро нигоҳ медорад, онро аз супернатант ҷудо кардан мумкин аст.
Чаро истихроҷи магнитиро истифода баред?
Технологияи истихроҷи чӯбҳои магнитӣ аз сабаби потенсиали он барои расмиёти истихроҷи зуд ва муассир, торафт бештар паҳн мешавад. Дар вақтҳои охир таҳияи маҳтобҳои магнитии хеле функсионалӣ бо системаҳои мувофиқи буферӣ ба вуҷуд омадаанд, ки автоматикунонии истихроҷи кислотаи нуклеинӣ ва ҷараёни кориро, ки хеле сабук ва камхарҷ аст, имконпазир гардонд. Инчунин, усулҳои истихроҷи чӯбҳои магнитӣ қадамҳои центрифугаро дар бар намегиранд, ки метавонанд ба қувваҳои буриш оварда расонанд, ки қисмҳои дарозтари ДНК-ро вайрон кунанд. Ин маънои онро дорад, ки риштаҳои дарозтари ДНК бетағйир боқӣ мемонанд, ки дар санҷиши геномика муҳим аст.
Вақти фиристодан: Ноябр-25-2022