Гарчанде ки дар назария, як молекулаи қолаб кофӣ хоҳад буд, миқдори хеле зиёди ДНК маъмулан барои PCR классикӣ истифода мешавад, масалан, то 1 мкг ДНК-и геномии ширхӯрон ва камтар аз 1 пг ДНК плазмидӣ. Маблағи оптималии асосан аз шумораи нусхаҳои пайдарпаии мақсаднок, инчунин аз мураккабии он вобаста аст.
Агар қолаби хеле кам истифода шавад, барои ба даст овардани миқдори кофии маҳсулот афзоиши мувофиқи шумораи давраҳои пурқувваткунӣ лозим мешавад. Полимеразаи Taq, ки барои аксари таҷрибаҳои PCR истифода мешавад, функсияи ислоҳӣ надорад (фаъолияти 3′-5′ экзонуклеаз); ҳамин тавр, хатогиҳое, ки ҳангоми пурқувваткунӣ рух медиҳанд, ислоҳ карда намешаванд. Чӣ қадаре ки шумораи давраҳо зиёд бошад, афзоиши маҳсулоти ноқис ҳамон қадар бештар паҳн мешавад. Агар, аз тарафи дигар, миқдори қолиб хеле зиёд бошад, эҳтимолияти ба дигар пайдарпайҳо (на сад дарсади иловагиҳо) мубаддал шудани праймерҳо, инчунин ташаккули димерҳои праймер зиёд мешавад, ки боиси пурқувват шудани махсулоти иловагй. Дар бисёр ҳолатҳо, ДНК аз фарҳангҳои ҳуҷайра ё аз микроорганизмҳо ҷудо карда мешавад ва баъдан ҳамчун қолаби PCR истифода мешавад. Пас аз тозакунӣ, консентратсияи ДНК-ро муайян кардан лозим аст, то ҳаҷме, ки барои танзими PCR лозим аст, муайян карда шавад. Гарчанде ки электрофорези гели агароз метавонад барои пешниҳоди тахмин хидмат кунад, ин усул аз дақиқ дур аст. Спектрофотометрияи UV-Vis ҳамчун стандарти тиллоӣ барои муайян кардани миқдори кислотаҳои нуклеинӣ муқаррар шудааст; ин усули мустақим ва аз ин рӯ осон ва зуд ҷаббиши намунаро дар 260 нм чен мекунад ва консентратсия бо ёрии омили табдилдиҳӣ ҳисоб карда мешавад.
Агар консентратсияи ДНК хеле паст бошад (< 1 мкг/мл dsDNA) ё агар он бо моддаҳое, ки дар диапазони 260 нм ҷабб мешаванд (масалан, РНК, сафеда, намакҳо) олуда бошад, ин усул ба маҳдудиятҳои худ мерасад. Дар ҳолати консентратсияи хеле паст, хонишҳо ба зудӣ аз ҳад зиёд нодуруст мешаванд ва ифлосшавӣ ба (баъзан аз ҳад зиёд) баҳодиҳии арзиши воқеӣ оварда мерасонад. Дар ин ҳолат, миқдор бо истифода аз флуоресцент метавонад алтернатива пешниҳод кунад. Ин техника ба истифодаи рангҳои флуоресцентӣ асос ёфтааст, ки махсус ба dsDNA мепайвандад, танҳо маҷмӯи дорои кислотаи нуклеинӣ ва ранг аз рӯшноӣ ҳаяҷон мекунад ва баъдан он нури дарозии мавҷи каме баландтар мебарорад. Дар ин ҷо шиддатнокии сигнали флуоресцентӣ ба миқдори ДНК мутаносиб аст ва барои муайян кардани консентратсияи он нисбат ба каҷи стандартӣ баҳо дода мешавад. Бартарии ин усул ба хосияти пайванд вобаста аст, ки таъсири берунаеро, ки бо ифлосшавӣ ба вуҷуд омадаанд, истисно мекунад ва инчунин ба қобилияти дар натиҷа ошкор кардани консентратсияи хеле пасти ДНК. Муносиб будани ҳарду усул асосан аз консентратсияи намуна ва тозагӣ вобаста аст; дар бисьёр мавридхо хатто ба максад мувофик аст, ки хар ду усулро дар як вакт истифода бурдан мумкин аст.
Вақти фиристодан: Ноябр-30-2022