నా PCR ప్రతిచర్యకు మనం ఎంత టెంప్లేట్ జోడించాలి?

సిద్ధాంతంలో ఉన్నప్పటికీ, టెంప్లేట్ యొక్క ఒక అణువు సరిపోతుంది, సాధారణంగా క్లాసిక్ PCR కోసం DNA యొక్క పెద్ద మొత్తంలో ఉపయోగిస్తారు, ఉదాహరణకు, 1 µg వరకు జన్యుసంబంధమైన క్షీరద DNA మరియు 1 pg ప్లాస్మిడ్ DNA. సరైన మొత్తం లక్ష్య శ్రేణి యొక్క కాపీల సంఖ్యపై, అలాగే దాని సంక్లిష్టతపై ఎక్కువగా ఆధారపడి ఉంటుంది.

చాలా తక్కువ టెంప్లేట్ ఉపయోగించబడితే, తగినంత మొత్తంలో ఉత్పత్తిని పొందేందుకు యాంప్లిఫికేషన్ సైకిళ్ల సంఖ్యలో సంబంధిత పెరుగుదల అవసరం. చాలా PCR ప్రయోగాలకు ఉపయోగించే ఒక Taq పాలిమరేస్ దిద్దుబాటు ఫంక్షన్‌ను కలిగి ఉండదు (3′-5′ ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీ); అందువల్ల, విస్తరణ సమయంలో సంభవించే లోపాలను సరిదిద్దలేము. చక్రాల సంఖ్య ఎక్కువగా ఉంటే, లోపభూయిష్ట ఉత్పత్తి యొక్క విస్తరణ మరింత ప్రబలంగా ఉంటుంది. మరోవైపు, టెంప్లేట్ మొత్తం చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, ఇతర (వంద శాతం కాంప్లిమెంటరీ కాదు) సీక్వెన్స్‌లకు ప్రైమర్‌ల సంభావ్యత, అలాగే ప్రైమర్ డైమర్‌ల ఏర్పాటు పెరుగుతుంది, దీని ఫలితంగా విస్తరణ జరుగుతుంది ఉప ఉత్పత్తులు. అనేక సందర్భాల్లో, DNA కణ సంస్కృతుల నుండి లేదా సూక్ష్మజీవుల నుండి వేరుచేయబడుతుంది మరియు తరువాత PCR టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది. శుద్దీకరణ తర్వాత, PCR సెటప్‌కు అవసరమైన వాల్యూమ్‌ను నిర్వచించగలిగేలా DNA ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడం అవసరం. అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ అంచనాను అందించడానికి ఉపయోగపడుతుంది, ఈ పద్ధతి ఖచ్చితమైనది కాదు. UV-Vis స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీ న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల పరిమాణానికి బంగారు ప్రమాణంగా స్థాపించబడింది; ఈ ప్రత్యక్ష మరియు అందువల్ల సులభమైన మరియు శీఘ్ర పద్ధతి 260 nm వద్ద నమూనా యొక్క శోషణను కొలుస్తుంది మరియు ఏకాగ్రత మార్పిడి కారకం సహాయంతో లెక్కించబడుతుంది.

DNA గాఢత చాలా తక్కువగా ఉంటే, అయితే (< 1 µg/mL dsDNA), లేదా అది 260 nm పరిధిలో (ఉదా RNA, ప్రోటీన్, లవణాలు) గ్రహించే పదార్థాలతో కలుషితమైతే, ఈ పద్ధతి దాని పరిమితులను చేరుకుంటుంది. చాలా తక్కువ సాంద్రతలు ఉన్న సందర్భంలో, రీడింగ్‌లు ఉపయోగించడం చాలా సరికాదు మరియు కలుషితాలు వాస్తవ విలువ యొక్క (కొన్నిసార్లు అపారమైన) అధిక అంచనాకు దారి తీస్తుంది. ఈ సందర్భంలో, ఫ్లోరోసెన్స్ ఉపయోగించి పరిమాణీకరణ ప్రత్యామ్నాయాన్ని అందించవచ్చు. ఈ సాంకేతికత ఫ్లోరోసెంట్ డైని ఉపయోగించడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఇది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ మరియు డైతో కూడిన కాంప్లెక్స్‌తో కూడిన కాంప్లెక్స్ మాత్రమే dsDNAతో బంధిస్తుంది మరియు ఇది తదనంతరం కొంచెం ఎక్కువ తరంగదైర్ఘ్యం కలిగిన కాంతిని విడుదల చేస్తుంది. ఇక్కడ, ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ యొక్క తీవ్రత DNA మొత్తానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది మరియు ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడానికి ఇది ప్రామాణిక వక్రరేఖకు సంబంధించి మూల్యాంకనం చేయబడుతుంది. ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రయోజనాలు బంధం యొక్క విశిష్టతపై ఆధారపడి ఉంటాయి, ఇది కాలుష్యం ద్వారా పరిచయం చేయబడిన బాహ్య ప్రభావాలను మినహాయిస్తుంది, అలాగే DNA యొక్క అతి తక్కువ సాంద్రతలను గుర్తించే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది. ఏదైనా పద్ధతి యొక్క అనుకూలత ప్రధానంగా నమూనా ఏకాగ్రత మరియు స్వచ్ఛతపై ఆధారపడి ఉంటుంది; అనేక సందర్భాల్లో రెండు పద్ధతులను సమాంతరంగా వర్తింపజేయడం కూడా మంచిది.