నా పిసిఆర్ ప్రతిచర్యకు మనం ఎంత టెంప్లేట్‌ను జోడించాలి?

సిద్ధాంతంలో, టెంప్లేట్ యొక్క ఒక అణువు సరిపోతుంది, చాలా పెద్ద మొత్తంలో DNA సాధారణంగా క్లాసిక్ PCR కోసం ఉపయోగించబడుతుంది, ఉదాహరణకు, 1 µg జన్యు క్షీరద DNA వరకు మరియు 1 pg ప్లాస్మిడ్ DNA వరకు. సరైన మొత్తం ఎక్కువగా లక్ష్య క్రమం యొక్క కాపీల సంఖ్యపై, అలాగే దాని సంక్లిష్టతపై ఆధారపడి ఉంటుంది.

చాలా తక్కువ టెంప్లేట్ ఉపయోగించినట్లయితే, తగినంత ఉత్పత్తిని పొందటానికి యాంప్లిఫికేషన్ చక్రాల సంఖ్యలో పెరుగుదల అవసరం. చాలా పిసిఆర్ ప్రయోగాలకు ఉపయోగించే టాక్ పాలిమరేస్ దిద్దుబాటు ఫంక్షన్‌ను కలిగి ఉండదు (3′-5 ′ ఎక్సోన్యూకలీస్ కార్యాచరణ); అందువల్ల, విస్తరణ సమయంలో సంభవించే లోపాలను సరిదిద్దలేము. చక్రాల సంఖ్య ఎక్కువ, లోపభూయిష్ట ఉత్పత్తి యొక్క విస్తరణ ఎక్కువగా ఉంటుంది. మరోవైపు, టెంప్లేట్ మొత్తం చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, ప్రైమర్‌ల సంభావ్యత ఇతర (వంద శాతం కాంప్లిమెంటరీ కాదు) సన్నివేశాలకు ఎనియలింగ్, అలాగే ప్రైమర్ డైమర్‌ల ఏర్పాటు, పెరుగుతుంది, దీని ఫలితంగా విస్తరణ జరుగుతుంది ఉప ఉత్పత్తులు. అనేక సందర్భాల్లో, DNA కణ సంస్కృతుల నుండి లేదా సూక్ష్మజీవుల నుండి వేరుచేయబడుతుంది మరియు తరువాత PCR మూసగా ఉపయోగించబడుతుంది. శుద్దీకరణను అనుసరించి, PCR సెటప్‌కు అవసరమైన వాల్యూమ్‌ను నిర్వచించగలిగేలా DNA యొక్క ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడం అవసరం. అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ఒక అంచనాను అందించడానికి ఉపయోగపడుతుంది, ఈ పద్ధతి ఖచ్చితమైనది కాదు. న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల పరిమాణానికి UV-vis స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీ బంగారు ప్రమాణంగా స్థాపించబడింది; ఈ ప్రత్యక్ష మరియు సులభమైన మరియు శీఘ్ర పద్ధతి 260 nm వద్ద నమూనా యొక్క శోషణను కొలుస్తుంది మరియు మార్పిడి కారకం సహాయంతో ఏకాగ్రత లెక్కించబడుతుంది.

అయితే, DNA గా ration త చాలా తక్కువగా ఉంటే (<1 µg/ml DSDNA), లేదా 260 nm పరిధిలో (ఉదా. RNA, ప్రోటీన్, లవణాలు) కూడా గ్రహించిన పదార్ధాలతో కలుషితమైతే, ఈ పద్ధతి దాని పరిమితులను చేరుకుంటుంది. చాలా తక్కువ సాంద్రతల విషయంలో, రీడింగులు త్వరలో ఉపయోగపడటానికి చాలా సరికానివిగా మారతాయి మరియు కలుషితాలు వాస్తవ విలువను (కొన్నిసార్లు అపారమైన) అతిగా అంచనా వేయడానికి దారితీస్తాయి. ఈ సందర్భంలో, ఫ్లోరోసెన్స్ ఉపయోగించి పరిమాణీకరణ ప్రత్యామ్నాయాన్ని కలిగి ఉంటుంది. ఈ సాంకేతికత ఫ్లోరోసెంట్ డైని ఉపయోగించడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఇది ప్రత్యేకంగా DSDNA తో బంధిస్తుంది, న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం మరియు రంగుతో కూడిన కాంప్లెక్స్ మాత్రమే కాంతి ద్వారా ఉత్తేజితమవుతుంది మరియు తరువాత ఇది కొంచెం ఎక్కువ తరంగదైర్ఘ్యం యొక్క కాంతిని విడుదల చేస్తుంది. ఇక్కడ, ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ యొక్క తీవ్రత DNA మొత్తానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది మరియు ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడానికి ఇది ప్రామాణిక వక్రతకు సంబంధించి అంచనా వేయబడుతుంది. ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రయోజనాలు బాండ్ యొక్క విశిష్టతపై ఆధారపడి ఉంటాయి, ఇది కాలుష్యం ద్వారా ప్రవేశపెట్టిన బాహ్య ప్రభావాలను మినహాయించింది, అలాగే DNA యొక్క చాలా తక్కువ సాంద్రతలను గుర్తించే సామర్థ్యంపై. ఈ పద్ధతి యొక్క అనుకూలత ప్రధానంగా నమూనా ఏకాగ్రత మరియు స్వచ్ఛతపై ఆధారపడి ఉంటుంది; చాలా సందర్భాల్లో, రెండు పద్ధతులను సమాంతరంగా వర్తింపచేయడం కూడా మంచిది.