கோட்பாட்டில் இருந்தாலும், வார்ப்புருவின் ஒரு மூலக்கூறு போதுமானதாக இருக்கும், கணிசமாக பெரிய அளவு டி.என்.ஏ பொதுவாக ஒரு உன்னதமான பி.சி.ஆருக்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது, எடுத்துக்காட்டாக, 1 µg வரை மரபணு பாலூட்டிகளின் டி.என்.ஏ மற்றும் 1 பி.ஜி. உகந்த தொகை பெரும்பாலும் இலக்கு வரிசையின் நகல்களின் எண்ணிக்கையையும், அதன் சிக்கலையும் சார்ந்துள்ளது.
மிகக் குறைந்த வார்ப்புரு பயன்படுத்தப்பட்டால், போதுமான அளவு உற்பத்தியைப் பெறுவதற்கு பெருக்க சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு தேவைப்படும். பெரும்பாலான பி.சி.ஆர் சோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு TAQ பாலிமரேஸ் ஒரு திருத்தம் செயல்பாட்டைக் கொண்டிருக்கவில்லை (3′-5 ′ எக்ஸோனுலீஸ் செயல்பாடு); எனவே, பெருக்கத்தின் போது ஏற்படும் பிழைகளை சரிசெய்ய முடியாது. சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை அதிகமாக இருப்பதால், குறைபாடுள்ள உற்பத்தியின் பெருக்கம் அதிகமாக இருக்கும். மறுபுறம், வார்ப்புருவின் அளவு மிக அதிகமாக இருந்தால், ப்ரைமர்களின் நிகழ்தகவு மற்றவர்களுக்கு (நூறு சதவிகித பாராட்டு அல்ல) காட்சிகளுக்கும், ப்ரைமர் டைமர்களின் உருவாக்கமும் அதிகரிக்கும், இதன் விளைவாக பெருக்கம் ஏற்படும் துணை தயாரிப்புகள். பல சந்தர்ப்பங்களில், டி.என்.ஏ செல் கலாச்சாரங்களிலிருந்து அல்லது நுண்ணுயிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டு பின்னர் பி.சி.ஆர் வார்ப்புருவாக பயன்படுத்தப்படுகிறது. சுத்திகரிப்பைத் தொடர்ந்து, பி.சி.ஆர் அமைப்பிற்குத் தேவையான அளவை வரையறுக்க டி.என்.ஏவின் செறிவை தீர்மானிக்க வேண்டியது அவசியம். அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் ஒரு மதிப்பீட்டை வழங்க உதவும் என்றாலும், இந்த முறை துல்லியமாக இல்லை. யு.வி-விஸ் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி நியூக்ளிக் அமிலங்களை அளவிடுவதற்கான தங்கத் தரமாக நிறுவப்பட்டுள்ளது; இந்த நேரடி மற்றும் எனவே எளிதான மற்றும் விரைவான முறை 260 என்.எம் மாதிரியின் உறிஞ்சுதலை அளவிடுகிறது, மேலும் மாற்று காரணியின் உதவியுடன் செறிவு கணக்கிடப்படுகிறது.
இருப்பினும், டி.என்.ஏ செறிவு மிகக் குறைவாக இருந்தால், (<1 µg/mL DSDNA), அல்லது 260 nm வரம்பில் (எ.கா. ஆர்.என்.ஏ, புரதம், உப்புகள்) உறிஞ்சும் பொருட்களால் மாசுபட்டிருந்தால், இந்த முறை அதன் வரம்புகளை எட்டும். மிகக் குறைந்த செறிவுகளின் விஷயத்தில், அளவீடுகள் விரைவில் பயன்பாட்டில் இல்லாதது மிகவும் துல்லியமாக மாறும், மேலும் மாசுபாடுகள் உண்மையான மதிப்பை மிகைப்படுத்திய (சில நேரங்களில் மகத்தானவை) வழிவகுக்கும். இந்த வழக்கில், ஃப்ளோரசன்ஸைப் பயன்படுத்தி அளவிடுதல் ஒரு மாற்றீட்டை முன்வைக்கக்கூடும். இந்த நுட்பம் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் சாயத்தைப் பயன்படுத்துவதை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இது குறிப்பாக டி.எஸ்.டி.என்.ஏ உடன் பிணைக்கிறது நியூக்ளிக் அமிலம் மற்றும் சாயத்தை உள்ளடக்கிய சிக்கலானது ஒளியால் உற்சாகமாக இருக்கிறது, பின்னர் அது சற்று அதிக அலைநீளத்தின் ஒளியை வெளியிடும். இங்கே, ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலின் தீவிரம் டி.என்.ஏவின் அளவிற்கு விகிதாசாரமாகும், மேலும் செறிவை தீர்மானிக்க இது ஒரு நிலையான வளைவு தொடர்பாக மதிப்பீடு செய்யப்படுகிறது. இந்த முறையின் நன்மைகள் பிணைப்பின் குறிப்பிட்ட தன்மையில் உள்ளன, இது மாசுபாட்டால் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட வெளிப்புற தாக்கங்களை விலக்குகிறது, அத்துடன் டி.என்.ஏவின் மிகக் குறைந்த செறிவுகளைக் கண்டறியும் திறன். எந்தவொரு முறையின் பொருத்தமும் முக்கியமாக மாதிரி செறிவு மற்றும் தூய்மையைப் பொறுத்தது; பல சந்தர்ப்பங்களில் இரண்டு முறைகளையும் இணையாகப் பயன்படுத்துவது கூட நல்லது.
இடுகை நேரம்: நவம்பர் -30-2022