Utangulizi
Uchimbaji wa asidi ya kiini ni nini?
Katika maneno rahisi sana, uchimbaji wa asidi ya kiini ni kuondolewa kwa RNA na/au DNA kutoka kwa sampuli na ziada yote ambayo sio lazima. Mchakato wa uchimbaji hutenga asidi ya kiini kutoka kwa sampuli na huzaa kwa njia ya eluate iliyojilimbikizia, isiyo na vifaa na uchafu ambao unaweza kuathiri matumizi yoyote ya chini.
Maombi ya uchimbaji wa asidi ya kiini
Asidi za kiini zilizosafishwa hutumiwa katika idadi kubwa ya matumizi tofauti, kuanzia tasnia nyingi tofauti. Huduma ya afya labda ni eneo ambalo hutumiwa zaidi, na RNA iliyosafishwa na DNA inahitajika kwa mwenyeji wa madhumuni tofauti ya upimaji.
Maombi ya uchimbaji wa asidi ya kiini katika huduma ya afya ni pamoja na:
- Utaratibu wa kizazi kijacho (NGS)
- Amplization-msingi SNP genotyping
- Array-msingi genotyping
- Digestion ya kizuizi cha enzyme
- Inachambua kwa kutumia enzymes za kurekebisha (mfano ligation na cloning)
Kuna pia shamba zingine zaidi ya huduma ya afya ambapo uchimbaji wa asidi ya kiini hutumiwa, pamoja na lakini sio mdogo kwa upimaji wa baba, uchunguzi wa macho na genomics.
Historia fupi ya uchimbaji wa asidi ya kiini
Uchimbaji wa DNAIlianzia nyuma kwa njia ndefu, na kutengwa kwa kwanza kujulikana kuwa ilifanywa na daktari wa Uswizi anayeitwa Friedrich Miescher mnamo 1869. Miescher alikuwa anatarajia kutatua kanuni za msingi za maisha kwa kuamua muundo wa kemikali wa seli. Baada ya kushindwa na lymphocyte, aliweza kupata kiboreshaji cha DNA kutoka kwa leucocytes zilizopatikana kwenye pus kwenye bandeji zilizokataliwa. Alifanya hivyo kwa kuongeza asidi na kisha alkali kwenye kiini ili kuacha cytoplasm ya seli, na kisha akatengeneza itifaki ya kutenganisha DNA na protini zingine.
Kufuatia utafiti wa kuvunja ardhi wa Miescher, wanasayansi wengine wengi wameendelea kuendeleza na kukuza mbinu za kutenganisha na kusafisha DNA. Edwin Joseph Cohn, mwanasayansi wa protini aliendeleza mbinu nyingi za utakaso wa protini wakati wa WW2. Alikuwa na jukumu la kutenganisha sehemu ya serum albin ya plasma ya damu, ambayo ni muhimu katika kudumisha shinikizo la osmotic katika mishipa ya damu. Hii ilikuwa muhimu kwa kuwaweka askari hai.
Mnamo 1953 Francis Crick, pamoja na Rosalind Franklin na James Watson, waliamua muundo wa DNA, kuonyesha kwamba ilitengenezwa na kamba mbili za minyororo mirefu ya nucleotides ya asidi. Ugunduzi huu wa mafanikio ulisababisha njia ya Meselson na Stahl, ambao waliweza kukuza itifaki ya gradient centrifugation kutenganisha DNA kutoka kwa bakteria ya E. coli kwani walionyesha replication ya kihafidhina ya DNA wakati wa jaribio lao la 1958.
Mbinu za uchimbaji wa asidi ya kiini
Je! Ni hatua gani 4 za uchimbaji wa DNA?
Njia zote za uchimbaji huchemka hadi hatua sawa za msingi.
Usumbufu wa seli. Hatua hii, inayojulikana pia kama lysis ya seli, inajumuisha kuvunja ukuta wa seli na/au membrane ya seli, ili kutolewa maji ya ndani yaliyo na asidi ya kiini ya riba.
Kuondolewa kwa uchafu usiohitajika. Hii ni pamoja na lipids za membrane, protini na asidi zingine zisizohitajika za kiini ambazo zinaweza kuingiliana na matumizi ya chini ya maji.
Kujitenga. Kuna njia kadhaa tofauti za kutenganisha asidi ya kiini ya riba kutoka kwa lysate iliyosafishwa uliyounda, ambayo huanguka kati ya aina mbili kuu: suluhisho la msingi au hali thabiti (tazama sehemu inayofuata).
Ukolezi. Baada ya asidi ya kiini imetengwa kutoka kwa uchafu na uchafu mwingine wote, huwasilishwa kwa eluate iliyowekwa sana.
Aina mbili za uchimbaji
Kuna aina mbili za uchimbaji wa asidi ya kiini - njia za msingi wa suluhisho na njia thabiti za hali. Njia ya msingi wa suluhisho pia inajulikana kama njia ya uchimbaji wa kemikali, kwani inajumuisha kutumia kemikali kuvunja seli na kupata nyenzo za kiini. Hii inaweza kutumia misombo ya kikaboni kama vile phenol na chloroform, au isiyo na madhara na kwa hivyo misombo iliyopendekezwa zaidi ya isokaboni kama vile proteinase K au silika.
Mifano ya njia tofauti za uchimbaji wa kemikali kuvunja kiini ni pamoja na:
- Osmotic RUPIPURE ya membrane
- Enzymatic digestion ya ukuta wa seli
- Solubilisation ya membrane
- na sabuni
- na matibabu ya alkali
Mbinu za hali ngumu, pia inajulikana kama njia za mitambo, inajumuisha kutumia jinsi DNA inavyoingiliana na sehemu ndogo. Kwa kuchagua bead au molekuli ambayo DNA itafunga lakini mchambuzi hataweza, inawezekana kutenganisha hizo mbili. Mfano wa mbinu za uchimbaji wa awamu-pamoja ikiwa ni pamoja na kutumia silika na shanga za sumaku.
Uchimbaji wa shanga ya sumaku ulielezea
Njia ya uchimbaji wa bead ya sumaku
Uwezo wa uchimbaji kwa kutumia shanga za sumaku ulitambuliwa kwanza katika patent ya Amerika iliyowasilishwa na Trevor Hawkins, kwa Taasisi ya Utafiti ya Taasisi ya Whitehead. Patent hii ilikubali kwamba inawezekana kutoa vifaa vya maumbile kwa kuwafunga kwa mtoaji wa msaada thabiti, ambayo inaweza kuwa bead ya sumaku. Kanuni ni kwamba unatumia bead ya sumaku inayofanya kazi sana ambayo nyenzo za maumbile zitafunga, ambayo inaweza kutengwa kutoka kwa supernatant kwa kutumia nguvu ya sumaku nje ya chombo kinachoshikilia sampuli.
Kwa nini utumie uchimbaji wa bead ya sumaku?
Teknolojia ya uchimbaji wa shanga ya sumaku inazidi kuongezeka, kwa sababu ya uwezo unaoshikilia kwa taratibu za uchimbaji wa haraka na mzuri. Katika siku za hivi karibuni kumekuwa na maendeleo ya shanga za sumaku zinazofanya kazi sana na mifumo inayofaa ya buffer, ambayo imefanya automatisering ya uchimbaji wa asidi ya kiini na mtiririko wa kazi ambao ni nyepesi sana na gharama nafuu. Pia, njia za uchimbaji wa bead ya sumaku hazihusishi hatua za centrifugation ambazo zinaweza kusababisha vikosi vya shear ambavyo vinavunja vipande virefu vya DNA. Hii inamaanisha kuwa kamba ndefu za DNA zinabaki kuwa sawa, ambayo ni muhimu katika upimaji wa genomics.
Wakati wa chapisho: Novemba-25-2022