Ingawa katika nadharia, molekuli moja ya kiolezo inaweza kutosha, kiasi kikubwa zaidi cha DNA hutumiwa kwa PCR ya kawaida, kwa mfano, hadi 1 µg ya DNA ya mamalia ya genomic na kidogo kama pg 1 ya DNA ya plasmid. Kiasi bora kinategemea kwa kiasi kikubwa idadi ya nakala za mlolongo wa lengo, na pia juu ya utata wake.
Ikiwa template kidogo sana inatumiwa, ongezeko sambamba la idadi ya mizunguko ya kukuza itahitajika ili kupata kiasi cha kutosha cha bidhaa. Taq polymerase ambayo hutumiwa kwa majaribio mengi ya PCR haina kipengele cha kusahihisha (shughuli ya 3′-5′ exonuclease); kwa hivyo, makosa yanayotokea wakati wa ukuzaji hayawezi kusahihishwa. Kadiri idadi ya mizunguko inavyoongezeka, ndivyo uboreshaji wa bidhaa zenye kasoro utaenea zaidi. Ikiwa, kwa upande mwingine, kiasi cha template ni cha juu sana, uwezekano wa primers kuunganishwa kwa mlolongo mwingine (sio asilimia mia moja), pamoja na uundaji wa dimers za primer, itaongezeka, ambayo itasababisha upanuzi wa kwa-bidhaa. Mara nyingi, DNA hutengwa kutoka kwa tamaduni za seli au kutoka kwa vijidudu na kisha kutumika kama kiolezo cha PCR. Kufuatia utakaso, ni muhimu kuamua mkusanyiko wa DNA ili kuweza kufafanua kiasi kinachohitajika kwa usanidi wa PCR. Wakati electrophoresis ya gel ya agarose inaweza kutoa makadirio, njia hii ni mbali na sahihi. UV-Vis spectrophotometry imeanzishwa kama kiwango cha dhahabu cha kukadiria asidi nucleic; njia hii ya moja kwa moja na kwa hiyo rahisi na ya haraka hupima kunyonya kwa sampuli kwa 260 nm, na mkusanyiko huhesabiwa kwa msaada wa sababu ya uongofu.
Ikiwa ukolezi wa DNA ni mdogo sana, hata hivyo (< 1 µg/mL dsDNA), au ikiwa imechafuliwa na dutu ambazo pia hufyonza katika safu ya nm 260 (km RNA, protini, chumvi), njia hii itafikia kikomo chake. Katika hali ya viwango vya chini sana, usomaji hivi karibuni utakuwa sio sahihi sana kuwa wa matumizi, na uchafuzi utasababisha (wakati mwingine mkubwa) kukadiria kwa thamani halisi. Katika kesi hii, quantification kwa kutumia fluorescence inaweza kutoa mbadala. Mbinu hii inategemea utumiaji wa rangi ya umeme ambayo hufungamana hasa na dsDNA changamano kinachojumuisha asidi nukleiki na rangi huchangamshwa na mwanga, na baadaye itatoa mwanga wa urefu wa juu kidogo wa mawimbi. Hapa, ukubwa wa ishara ya fluorescent ni sawia na kiasi cha DNA, na kwa ajili ya kuamua mkusanyiko ni tathmini kuhusiana na curve ya kawaida. Faida za njia hii hutegemea maalum ya dhamana, ambayo haijumuishi mvuto wa nje unaoletwa na uchafuzi, na pia juu ya uwezo unaotokana wa kuchunguza viwango vya chini sana vya DNA. Kufaa kwa njia yoyote inategemea hasa mkusanyiko wa sampuli na usafi; katika hali nyingi inaweza hata kushauriwa kutumia njia zote mbili kwa sambamba.
Muda wa kutuma: Nov-30-2022