Kryovialeranvänds vanligtvis för kryogen lagring av cellinjer och andra kritiska biologiska material, i dewars fyllda med flytande kväve.

Det finns flera steg involverade i framgångsrik bevarande av celler i flytande kväve. Även om den grundläggande principen är en långsam frysning, beror den exakta tekniken som används på celltypen och kryoprotektanten. Det finns flera säkerhetshänsyn och bästa praxis att ta hänsyn till när man lagrar celler vid så låga temperaturer.

Detta inlägg syftar till att ge en översikt över hur kryovialer lagras i flytande kväve.

Vad är kryovialer

Cryovials är små, täckta injektionsflaskor designade för lagring av flytande prover vid extremt låga temperaturer. De säkerställer att celler som bevaras i kryoprotektant inte kommer i direktkontakt med det flytande kväve, vilket minimerar risken för cellulära frakturer samtidigt som det gynnas av den extrema kylningseffekten av flytande kväve.

Injektionsflaskorna finns vanligtvis i en rad volymer och mönster - de kan vara internt eller externt gängade med platta eller rundade botten. Sterila och icke-sterila format finns också tillgängliga.

Vem använderCyrovialeratt lagra celler i flytande kväve

Ett antal NHS och privata laboratorier, såväl som forskningsinstitutioner som specialiserat sig på navelsträngsblodbank, epitelcellbiologi, immunologi och stamcellbiologi använder kryovialer för att kryopreservera celler.

Celler bevarade på detta sätt inkluderar B- och T -celler, CHO -celler, hematopoietiska stam- och stamceller, hybridom, tarmceller, makrofager, mesenkymala stam- och stamceller, monocyter, myelom, NK -celler och pluripotenta stamceller.

Översikt över hur man lagrar kryovialer i flytande kväve

Cryopreservation är en process som bevarar celler och andra biologiska konstruktioner genom att kyla dem till mycket låga temperaturer. Celler kan lagras i flytande kväve i flera år utan förlust av cellviabilitet. Detta är en översikt över de procedurer som används.

Cellberedning

Den exakta metoden för framställning av prover kommer att variera beroende på celltypen, men i allmänhet samlas cellerna och centrifugeras för att utveckla en cellrik pellet. Denna pellet återsuspenderas sedan i supernatanten blandad med kryoprotektant eller ett kryokonserveringsmedium.

Kryopreservationsmedium

Detta medium används för att bevara celler i de lågtemperaturmiljöer som de kommer att underkastas genom att hämma bildningen av intra och extracellulära kristaller och därmed celldöd. Deras roll är att tillhandahålla en säker, skyddande miljö för celler och vävnader under frys-, lagrings- och tinningsprocesserna.

Ett medium såsom färsk frysta plasma (FFP), hepariniserad plasmalytösning eller serumfria, djurkomponentfria lösningar blandas med kryoprotektmedel såsom dimetylsulfoxid (DMSO) eller glycerol.

Den omtilltida provpelleten alikvoteras till polypropylenkryovialer somSuzhou Ace Biomedical Company Cryogenic Storage Inals.

Det är viktigt att inte överfylla kryovialerna eftersom detta kommer att öka risken för sprickbildning och eventuell frisättning av innehållet (1).

Kontrollerad frysfrekvens

I allmänhet används en långsam kontrollerad frysfrekvens för framgångsrik kryopreservation av celler.

Efter att prover har alikvats till kryogena injektionsflaskor placeras de på våt is eller i ett 4 ℃ kylskåp och frysproceduren startas inom 5 minuter. Som en allmän guide kyls cellerna med en hastighet av -1 till -3 per minut (2). Detta uppnås med hjälp av en programmerbar kylare eller genom att placera injektionsflaskor i en isolerad låda placerad i –70 ° C till –90 ° C kontrollerad frys.

Överföring till flytande kväve

De frysta kryogena injektionsflaskorna överförs sedan till en flytande kvävetank under obestämda perioder förutsatt att en temperatur på mindre än -135 ℃ bibehålls.

Dessa ultra-låga temperaturer kan erhållas genom nedsänkning i vätska eller ångfas kväve.

Flytande eller ångfas?

Lagring i kväve i flytande fas är känt för att upprätthålla den kalla temperaturen med absolut konsistens, men rekommenderas ofta inte av följande skäl:

• Behovet av stora volymer (djup) flytande kväve som är en potentiell fara. Förbränning eller kvävning på grund av detta är en verklig risk.
• Dokumenterade fall av korsföroreningar av smittämnen som Aspergillus, Hep B och viral spridning via det flytande kväve-mediet (2,3)
• Potentialen för flytande kväve att läcka in i injektionsflaskorna under nedsänkning. När den tas bort från förvaring och värms till rumstemperatur expanderar kvävet snabbt. Följaktligen kan injektionsflaskan krossa när den tas bort från flytande kvävelagring, vilket skapar en fara från både flygande skräp och exponering för innehållet (1, 4).

Av dessa skäl är ultra-låg temperaturlagring oftast i ångfaskväve. När prover måste förvaras i vätskefasen bör specialiserad kryoflexrör användas.

Nackdelen med ångfasen är att en vertikal temperaturgradient kan uppstå vilket resulterar i temperaturfluktuationer mellan -135 ℃ och -190 ℃. Detta kräver noggrann och flitig övervakning av de flytande kvävenivåerna och temperaturvariationerna (5).

Många tillverkare rekommenderar att kryovialer är lämpliga för lagring ner till -135 ℃ eller endast för användning i ångfasen.

Tina dina kryokonserverade celler

Tinningsförfarandet är stressande för en frusen kultur, och korrekt hantering och teknik krävs för att säkerställa optimal livskraft, återhämtning och funktionalitet hos cellerna. De exakta tiningsprotokollen beror på specifika celltyper. Snabb tining anses dock vara standard för:

• Minska någon påverkan på cellåterhämtning
• Hjälp till att minska exponeringstiden för de lösta ämnen som finns i frysande media
• Minimera skador genom iskristallisation

Vattenbad, pärlbad eller specialiserade automatiserade instrument används ofta för att tina prover.

Oftast tinas 1 cellinje i taget i 1-2 minuter, genom att försiktigt virvla i ett 37 ℃ vattenbad tills det bara finns en liten bit is kvar i injektionsflaskan innan de tvättas i ett förvärmat tillväxtmedium.

För vissa celler som däggdjursembryon är långsam uppvärmning avgörande för deras överlevnad.

Cellerna är nu redo för cellkultur, cellisolering eller i fallet med hematopoietiska stamceller - livskraftsstudier för att garantera integriteten hos givarstamcellerna före myeloablativ terapi.

Det är normal praxis att ta små alikvoter av det förbrända provet som används för att utföra ett cellantal för att bestämma cellkoncentrationer för plätering i kultur. Du kan sedan bedöma resultaten från cellisoleringsförfaranden och bestämma cellviabilitet.

Bästa metoder för lagring av kryovialer

Den framgångsrika kryokonserveringen av prover lagrade i kryovialer beror på många element i protokollet inklusive korrekt lagring och journalföring.

• Dela celler mellan lagringsplatser- Om volymer tillåter, delar celler mellan flaskor och lagrar dem på separata platser för att minska risken för provförlust på grund av utrustningsfel.
• Förhindra korsföroreningar-Välj sterila kryogena injektionsflaskor eller autoklaver före engångsbruk före efterföljande användning
• Använd injektionsflaskor med lämplig storlek för dina celler- Injektionsflaskor finns i en mängd volymer mellan 1 och 5 ml. Undvik överfyllning av injektionsflaskor för att minska risken för sprickor.
• Välj intern eller externt gängade kryogena injektionsflaskor- Internt gängade injektionsflaskor rekommenderas av vissa universitet för säkerhetsåtgärder - de kan också förhindra förorening under fyllning eller när de lagras i det flytande kväve.
• Förhindra läckage-Använd bi-injicerade tätningar gjutna i skruvkåpan eller O-ringarna för att förhindra läckage och förorening.
• Använd 2D -streckkoder och etikettflaskor- För att säkerställa spårbarhet gör det möjligt att vara tillräckliga märkt. 2D -streckkoder kan hjälpa till med lagringshantering och journalföring. Färgkodade mössor är användbara för enklare identifiering.
• Tillräckligt underhåll av lagring- För att säkerställa att celler inte går förlorade bör lagringskärl ständigt övervaka temperatur- och flytande kvävenivåerna. Larm bör monteras för att varna användare av fel.

Säkerhetsåtgärder

Flytande kväve har blivit vanlig praxis i modern forskning men medför risken för allvarlig skada om det används felaktigt.

Korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) bör bäras för att minimera risken för frostskador, brännskador och andra negativa incidenter vid hantering av flytande kväve. Bära

• Kryogena handskar
• Laboratorium
• Påverkningsbeständig full ansiktssköld som också täcker nacken
• Stängd tåskor
• Stänkfast plastförkläde

Flytande kvävekylskåp bör placeras i väl ventilerade områden för att minimera risken för kvävning-rymd kväve förångas och förskjuter atmosfäriskt syre. Stora volymlagrar bör ha låga syresystem.

Att arbeta i par när han hanterar flytande kväve är idealisk och dess användning utanför normal arbetstid bör vara förbjuden.

Cryovials för att stödja ditt arbetsflöde

Suzhou Ace Biomedical Company erbjuder ett brett urval av produkter som uppfyller dina kryopreservationsbehov för olika typer av celler. Portföljen innehåller en rad rörsor och en rad sterila kryovialer.

Våra kryovialer är:

• Lab skruvlock 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryoviala kryogena injektionsflaskor Konisk botten kryotube med packning

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikation, med kjol eller utan kjol
  ● Konisk eller självstående design, steril eller icke-steril är båda tillgängliga
  ● Skruvlockrör är gjorda av polypropen med medicinsk kvalitet
  ● PP Cryotube -injektionsflaskor kan frysas upprepade gånger
  ● Den yttre CAP -designen kan minska föroreningssannolikheten under provbehandling.
  ● Skruvmössa kryogena rör universella skruvtrådar för användning
  ● Rör passar vanligaste rotorer
  ● Cryogenic Tube O-ringrör passar standard 1-tum och 2-tums, 48well, 81well ， 96well och 100well fryslådor
  ● Autoklaverbar till 121 ° C och frysbar till -86 ° C

  Delnr	MATERIAL	VOLYM	LOCKFÄRG	PCS/VÄSKA	Väskor/fodral
  Akt05-bl-n	PP	0,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  Akt15-bl-n	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT15-BR-NW	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10