Kryovialeranvänds vanligtvis för kryogen lagring av cellinjer och andra kritiska biologiska material, i dewars fyllda med flytande kväve.

Det finns flera steg involverade i framgångsrik bevarande av celler i flytande kväve. Medan grundprincipen är en långsam frysning, beror den exakta tekniken som används på celltyp och kryoskyddsmedel som används. Det finns flera säkerhetsöverväganden och bästa praxis att ta hänsyn till vid förvaring av celler vid så låga temperaturer.

Det här inlägget syftar till att ge en översikt över hur kryovialer förvaras i flytande kväve.

Vad är kryovialer

Kryovialer är små flaskor med lock som är utformade för att lagra vätskeprover vid extremt låga temperaturer. De säkerställer att celler bevarade i kryoskyddsmedel inte kommer i direkt kontakt med flytande kväve, vilket minimerar risken för cellfrakturer samtidigt som de drar nytta av den extrema kyleffekten av flytande kväve.

Flaskorna finns vanligtvis i en mängd olika volymer och utföranden – de kan vara invändigt eller utvändigt gängade med platt eller rundad botten. Sterila och icke-sterila format finns också tillgängliga.

Vem använderCyrovialeratt lagra celler i flytande kväve

En rad NHS och privata laboratorier, såväl som forskningsinstitutioner som specialiserar sig på navelsträngsblodbanker, epitelcellsbiologi, immunologi och stamcellsbiologi använder kryovialer för att kryobevara celler.

Celler som bevaras på detta sätt inkluderar B- och T-celler, CHO-celler, hematopoetiska stam- och stamceller, hybridom, tarmceller, makrofager, mesenkymala stam- och stamceller, monocyter, myelom, NK-celler och pluripotenta stamceller.

Översikt över hur man förvarar kryovialer i flytande kväve

Kryokonservering är en process som bevarar celler och andra biologiska konstruktioner genom att kyla dem till mycket låga temperaturer. Celler kan lagras i flytande kväve i åratal utan förlust av cellviabilitet. Detta är en översikt över de förfaranden som används.

Cellförberedelse

Den exakta metoden för att förbereda prover kommer att variera beroende på celltyp, men i allmänhet samlas cellerna in och centrifugeras för att utveckla en cellrik pellet. Denna pellet återsuspenderas sedan i supernatanten blandad med kryoskyddsmedel eller ett kryokonserveringsmedium.

Kryokonserveringsmedium

Detta medium används för att bevara celler i de lågtemperaturmiljöer som de kommer att utsättas för genom att hämma bildningen av intra- och extracellulära kristaller och därmed celldöd. Deras roll är att tillhandahålla en säker, skyddande miljö för celler och vävnader under frysning, lagring och upptining.

Ett medium som färskfryst plasma (FFP), hepariniserad plasmalytlösning eller serumfria, animaliska komponentfria lösningar blandas med kryoskyddsmedel som dimetylsulfoxid (DMSO) eller glycerol.

Den återflytande provpelleten fördelas i alikvoter i polypropenkryovialer som t.exSuzhou Ace Biomedicinska företaget Cryogenic Storage Vials.

Det är viktigt att inte överfylla kryovialerna eftersom detta ökar risken för sprickbildning och eventuellt utsläpp av innehåll (1).

Kontrollerad fryshastighet

I allmänhet används en långsam kontrollerad fryshastighet för framgångsrik kryokonservering av celler.

Efter att proverna har fördelats i kryogena flaskor, placeras de på våt is eller i ett 4℃ kylskåp och frysningsproceduren påbörjas inom 5 minuter. Som en allmän vägledning kyls cellerna med en hastighet av -1 till -3 per minut (2). Detta uppnås med hjälp av en programmerbar kylare eller genom att placera flaskor i en isolerad låda placerad i en –70°C till –90°C kontrollerad frys.

Överför till flytande kväve

De frysta kryogena flaskorna överförs sedan till en tank för flytande kväve under obestämda perioder förutsatt att en temperatur på mindre än -135 ℃ upprätthålls.

Dessa ultralåga temperaturer kan erhållas genom nedsänkning i vätske- eller ångfas-kvävet.

Vätske- eller ångfas?

Lagring i flytande kväve är känt för att hålla den kalla temperaturen med absolut konsistens, men rekommenderas ofta inte av följande skäl:

• Behovet av stora volymer (djup) flytande kväve som är en potentiell fara. Brännskador eller kvävning på grund av detta är en verklig risk.
• Dokumenterade fall av korskontaminering av smittämnen som aspergillus, hep B och virusspridning via det flytande kvävemediet (2,3)
• Risken för flytande kväve att läcka in i flaskorna under nedsänkning. När det tas ur lagringen och värms till rumstemperatur expanderar kvävet snabbt. Följaktligen kan flaskan splittras när den tas bort från lagring av flytande kväve, vilket skapar en fara från både flygande skräp och exponering för innehållet (1, 4).

Av dessa skäl är lagring vid ultralåg temperatur oftast i ångfas-kväve. När prover måste förvaras i vätskefas, bör specialiserade kryoflexslangar användas.

Nackdelen med ångfasen är att en vertikal temperaturgradient kan uppstå vilket resulterar i temperaturfluktuationer mellan -135 ℃ och -190 ℃. Detta kräver noggrann och noggrann övervakning av halterna av flytande kväve och temperaturvariationer (5).

Många tillverkare rekommenderar att cryovials är lämpliga för förvaring ner till -135 ℃ eller endast för användning i ångfas.

Tina dina kryokonserverade celler

Upptiningsprocessen är stressande för en frusen kultur, och korrekt hantering och teknik krävs för att säkerställa optimal livsduglighet, återhämtning och funktionalitet hos cellerna. De exakta upptiningsprotokollen kommer att bero på specifika celltyper. Snabb upptining anses dock vara standard för:

• Minska eventuell påverkan på cellulär återhämtning
• Hjälp till att minska exponeringstiden för de lösta ämnen som finns i frysmediet
• Minimera eventuella skador genom isomkristallisation

Vattenbad, pärlbad eller specialiserade automatiserade instrument används vanligtvis för att tina prover.

Oftast tinas 1 cellinje åt gången i 1-2 minuter genom att försiktigt snurra i ett 37℃ vattenbad tills det bara finns en liten bit is kvar i flaskan innan de tvättas i ett förvärmt odlingsmedium.

För vissa celler som däggdjursembryon är långsam uppvärmning avgörande för deras överlevnad.

Cellerna är nu redo för cellodling, cellisolering eller i fallet med hematopoetiska stamceller – livsduglighetsstudier för att garantera donatorstamcellernas integritet före myeloablativ terapi.

Det är normal praxis att ta små alikvoter av det förtvättade provet som används för att utföra en cellräkning för att bestämma cellkoncentrationer för utplätering i kultur. Du kan sedan bedöma resultaten av cellisoleringsprocedurer och bestämma cellviabilitet.

Bästa praxis för förvaring av kryovialer

Den framgångsrika kryokonserveringen av prover som lagras i kryovialer beror på många element i protokollet, inklusive korrekt lagring och journalföring.

• Dela celler mellan lagringsplatser– Om volymerna tillåter, dela celler mellan flaskor och förvara dem på separata platser för att minska risken för provförlust på grund av utrustningsfel.
• Förhindra korskontaminering– Välj sterila kryogena engångsflaskor eller autoklav före efterföljande användning
• Använd flaskor av lämplig storlek för dina celler– injektionsflaskor finns i en mängd volymer mellan 1 och 5 ml. Undvik att överfylla flaskor för att minska risken för sprickbildning.
• Välj inre eller utvändigt gängade kryogena flaskor– Invändigt gängade flaskor rekommenderas av vissa universitet för säkerhetsåtgärder – de kan också förhindra kontaminering under fyllning eller när de förvaras i flytande kväve.
• Förhindra läckage- Använd bi-injicerade tätningar gjutna i skruvlocket eller O-ringarna för att förhindra läckage och kontaminering.
• Använd 2D-streckkoder och etikettflaskor– För att säkerställa spårbarhet, kan flaskor med stora skrivområden göra att varje flaska är tillräckligt märkt. 2D-streckkoder kan hjälpa till med lagringshantering och journalföring. Färgkodade kepsar är användbara för enklare identifiering.
• Tillräckligt underhåll av lagring- För att säkerställa att celler inte går förlorade bör lagringskärl ständigt övervaka temperaturen och nivåerna av flytande kväve. Larm bör monteras för att varna användarna om fel.

Säkerhetsföreskrifter

Flytande kväve har blivit vanligt förekommande inom modern forskning men medför risk för allvarliga skador om det används felaktigt.

Rätt personlig skyddsutrustning (PPE) bör bäras för att minimera risken för köldskador, brännskador och andra negativa incidenter vid hantering av flytande kväve. Bära

• Kryogena handskar
• Laboratorierock
• Slagtålig helansiktsskärm som även täcker nacken
• Stängda skor
• Stänksäkert plastförkläde

Kylskåp med flytande kväve bör placeras i välventilerade utrymmen för att minimera risken för kvävning – utsläppt kväve förångar och tränger undan atmosfäriskt syre. Stora butiker bör ha larmsystem för låg syre.

Att arbeta i par vid hantering av flytande kväve är idealiskt och dess användning utanför normal arbetstid bör förbjudas.

Kryovialer för att stödja ditt arbetsflöde

Suzhou Ace Biomedical-företaget erbjuder ett brett urval av produkter som uppfyller dina kryokonserveringsbehov för olika typer av celler. Portföljen inkluderar ett urval av rör såväl som ett urval av sterila cryovials.

Våra kryovialer är:

• Lab skruvlock 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryoviala kryogena flaskor Koniskt botten kryotub med packning

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikation, med kjol eller utan kjol
  ● Konisk eller självstående design, steril eller icke-steril är båda tillgängliga
  ● Skruvlocksrör är gjorda av polypropen av medicinsk kvalitet
  ● PP Cryotube-flaskor kan frysas och tinas upprepade gånger
  ●Den externa lockdesignen kan minska föroreningssannolikheten under provbehandlingen.
  ● Skruvlock kryogena rör Universalskruvgängor för användning
  ● Rör passar de flesta vanliga rotorer
  ● O-ringrör för kryogena rör passar standard 1-tums och 2-tums, 48 ​​brunnar, 81 brunnar, 96 brunnar och 100 brunnar frysboxar
  ● Autoklaverbar till 121°C och frysbar till -86°C

  DELNR	MATERIAL	VOLYM	LOCKFÄRG	PCS/VÄSKA	VÄSKOR/FODRAL
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10