Nukleinsyraktraktion och den magnetiska pärlmetoden

Introduktion

Vad är nukleinsyraktraktion?

I de mycket enklaste termerna är nukleinsyraktraktion avlägsnande av RNA och/eller DNA från ett prov och allt överskott som inte är nödvändigt. Processen för extraktion isolerar nukleinsyrorna från ett prov och ger dem i form av en koncentrerad eluat, fritt från utspädningsmedel och föroreningar som kan påverka alla nedströms tillämpningar.

Tillämpningar av nukleinsyraktraktion

Renade nukleinsyror används i en mängd olika tillämpningar, allt över flera olika industrier. Sjukvård är kanske det område där det används mest, med renat RNA och DNA som krävs för en mängd olika olika teständamål.

Tillämpningar av extraktion av nukleinsyran i hälso- och sjukvård inkluderar:

- PCR- och QPCR -amplifiering

- Nästa generations sekvensering (NGS)

- Amplifieringsbaserad SNP-genotypning

- Array-baserad genotypning

- Begränsning av enzym matsmältning

- Analyser med hjälp av modifierande enzymer (t.ex. ligering och kloning)

Det finns också andra fält utöver sjukvård där nukleinsyraktraktion används, inklusive men inte begränsat till faderskapstest, kriminaltekniker och genomik.

En kort historia av nukleinsyraktraktion

DNA -extraktiongår tillbaka långt, med den första kända isoleringen som har utförts av en schweizisk läkare vid namn Friedrich Miescher 1869. Miescher hoppades lösa de grundläggande principerna för liv genom att bestämma den kemiska sammansättningen av celler. Efter att ha misslyckats med lymfocyter kunde han erhålla en rå fällning av DNA från leukocyter som finns i pus på kasserade bandage. Han gjorde detta genom att tillsätta syra och sedan alkali till cellen för att lämna cellens cytoplasma och utvecklade sedan ett protokoll för att separera DNA från de andra proteinerna.

Efter Mieschers banbrytande forskning har många andra forskare gått vidare och utvecklat tekniker för att isolera och rena DNA. Edwin Joseph Cohn, en proteinforskare utvecklade många tekniker för proteinrening under andra världskriget. Han var ansvarig för att isolera serumalbuminfraktionen av blodplasma, vilket är viktigt för att upprätthålla det osmotiska trycket i blodkärlen. Detta var avgörande för att hålla soldater vid liv.

1953 bestämde Francis Crick, tillsammans med Rosalind Franklin och James Watson, strukturen för DNA, vilket visade att den bestod av två trådar av långa kedjor av nukleinsyrakleotider. Denna genombrottsupptäckt banade vägen för Meselson och Stahl, som kunde utveckla ett densitetsgradientcentrifugeringsprotokoll för att isolera DNA från E. coli-bakterier när de demonstrerade den halvkonservativa replikationen av DNA under deras experiment från 1958.

Tekniker för nukleinsyraktraktion

Vilka är de fyra stadierna av DNA -extraktion?
Alla extraktionsmetoder kokar ner till samma grundläggande steg.

Cellstörning. Detta steg, även känt som celllys, involverar att bryta ner cellväggen och/eller cellmembranet, för att frigöra de intracellulära vätskorna som innehåller nukleinsyrorna av intresse.

Avlägsnande av oönskat skräp. Detta inkluderar membranlipider, proteiner och andra oönskade nukleinsyror som kan störa applikationer nedströms.

Isolering. Det finns ett antal olika sätt att isolera nukleinsyrorna av intresse från det rensade lysatet du skapade, som faller mellan två huvudkategorier: lösningsbaserat eller fast tillstånd (se nästa avsnitt).

Koncentration. Efter att nukleinsyrorna har isolerats från alla andra föroreningar och utspädningsmedel presenteras de i en mycket koncentrerad eluat.

De två typerna av extraktion
Det finns två typer av nukleinsyraktraktion - lösningsbaserade metoder och fasta tillståndsmetoder. Den lösningsbaserade metoden är också känd som den kemiska extraktionsmetoden, eftersom den handlar om att använda kemikalier för att bryta ner cellen och få tillgång till nukleiskt material. Detta kan vara att använda antingen organiska föreningar såsom fenol och kloroform, eller de mindre skadliga och därför mer rekommenderade oorganiska föreningarna såsom proteinas K eller kiseldioxidgel.

Exempel på olika kemiska extraktionsmetoder för att bryta ner en cell inkluderar:

- osmotisk brustning av membran

- Enzymatisk matsmältning av cellväggen

- Solubilisering av membran

- Med tvättmedel

- med alkali -behandling

Solid tillståndstekniker, även kända som mekaniska metoder, innebär att utnyttja hur DNA interagerar med ett fast substrat. Genom att välja en pärla eller molekyl som DNA kommer att binda på men analyt inte kommer det, är det möjligt att separera de två. Exempel på extraktionstekniker för fast fas inklusive användning av kiseldioxid- och magnetpärlor.

Magnetpärlekstraktion förklarade

Den magnetiska pärlekstraktionsmetoden
Potentialen för extraktion med användning av magnetiska pärlor erkändes först i ett amerikanskt patent som inlämnats av Trevor Hawkins, för Whitehead Institute Research Institution. Detta patent erkände att det var möjligt att extrahera genetiskt material genom att binda dem till ett fast stödbärare, vilket kan vara en magnetisk pärla. Principen är att du använder en mycket funktionaliserad magnetisk pärla på vilken det genetiska materialet kommer att binda på, som sedan kan separeras från supernatanten genom att applicera en magnetisk kraft på utsidan av kärlet som håller provet.

Varför använda extraktion av magnetisk pärla?
Magnetisk pärluttagningsteknologi blir allt vanligare på grund av den potential som den har för snabba och effektiva extraktionsförfaranden. På senare tid har det skett utveckling av mycket funktionaliserade magnetpärlor med lämpliga buffertsystem, som har möjliggjort automatisering av nukleinsyraktraktion och ett arbetsflöde som är mycket resursljus och kostnadseffektivt. Magnetiska pärlekstraktionsmetoder involverar inte heller centrifugeringsstegen som kan orsaka skjuvkrafter som bryter upp längre bitar av DNA. Detta innebär att längre strängar av DNA förblir intakta, vilket är viktigt vid genomics -testning.