Nukleinsyraextraktion och den magnetiska pärlmetoden

Introduktion

Vad är nukleinsyraextraktion?

I de allra enklaste termerna är nukleinsyraextraktion avlägsnande av RNA och/eller DNA från ett prov och allt överskott som inte är nödvändigt. Extraktionsprocessen isolerar nukleinsyrorna från ett prov och ger dem i form av ett koncentrerat eluat, fritt från spädningsmedel och föroreningar som kan påverka eventuella nedströmsapplikationer.

Tillämpningar av nukleinsyraextraktion

Renade nukleinsyror används i en uppsjö av olika tillämpningar, som sträcker sig över flera olika industrier. Sjukvården är kanske det område där den används mest, med renat RNA och DNA som krävs för en mängd olika teständamål.

Tillämpningar av nukleinsyraextraktion inom sjukvården inkluderar:

- PCR och qPCR Amplifiering

- Next Generation Sequencing (NGS)

- Amplifieringsbaserad SNP-genotypning

- Array-baserad genotypning

- Restriktion Enzym Digestion

- Analyser med modifierande enzymer (t.ex. ligering och kloning)

Det finns även andra områden utöver hälso- och sjukvården där nukleinsyraextraktion används, inklusive men inte begränsat till faderskapstestning, kriminalteknik och genomik.

En kort historia av nukleinsyraextraktion

DNA-extraktiongår långt tillbaka i tiden, med den första kända isoleringen som utfördes av en schweizisk läkare vid namn Friedrich Miescher 1869. Miescher hoppades kunna lösa livets grundläggande principer genom att bestämma cellers kemiska sammansättning. Efter att ha misslyckats med lymfocyter kunde han få en rå fällning av DNA från leukocyter som hittats i pus på kasserade bandage. Han gjorde detta genom att tillsätta syra och sedan alkali till cellen för att lämna cellens cytoplasma, och utvecklade sedan ett protokoll för att separera DNA från de andra proteinerna.

Efter Mieschers banbrytande forskning har många andra forskare gått vidare och utvecklat tekniker för att isolera och rena DNA. Edwin Joseph Cohn, en proteinforskare utvecklade många tekniker för proteinrening under andra världskriget. Han var ansvarig för att isolera serumalbuminfraktionen i blodplasma, vilket är viktigt för att upprätthålla det osmotiska trycket i blodkärlen. Detta var avgörande för att hålla soldaterna vid liv.

År 1953 bestämde Francis Crick, tillsammans med Rosalind Franklin och James Watson, strukturen av DNA, vilket visade att det bestod av två strängar av långa kedjor av nukleinsyranukleotider. Denna banbrytande upptäckt banade väg för Meselson och Stahl, som kunde utveckla ett densitetsgradientcentrifugeringsprotokoll för att isolera DNA från E. Coli-bakterier när de demonstrerade den semi-konservativa replikeringen av DNA under sitt experiment från 1958.

Tekniker för nukleinsyraextraktion

Vilka är de fyra stadierna av DNA-extraktion?
Alla utvinningsmetoder kokar ner till samma grundläggande steg.

Cellstörning. Detta stadium, även känt som cellys, involverar att bryta ner cellväggen och/eller cellmembranet för att frigöra de intracellulära vätskorna som innehåller de intressanta nukleinsyrorna.

Borttagning av oönskat skräp. Detta inkluderar membranlipider, proteiner och andra oönskade nukleinsyror som kan störa nedströmsapplikationer.

Isolering. Det finns ett antal olika sätt att isolera nukleinsyrorna av intresse från det rensade lysatet du skapade, som faller mellan två huvudkategorier: lösningsbaserad eller fast tillstånd (se nästa avsnitt).

Koncentration. Efter att nukleinsyrorna har isolerats från alla andra föroreningar och spädningsmedel presenteras de i ett högkoncentrerat eluat.

De två typerna av extraktion
Det finns två typer av nukleinsyraextraktion - lösningsbaserade metoder och fasta tillståndsmetoder. Den lösningsbaserade metoden är också känd som den kemiska extraktionsmetoden, eftersom den innebär att man använder kemikalier för att bryta ner cellen och komma åt nukleinmaterialet. Detta kan vara att använda antingen organiska föreningar som fenol och kloroform, eller de mindre skadliga och därför mer rekommenderade oorganiska föreningarna som Proteinas K eller silikagel.

Exempel på olika kemiska extraktionsmetoder för att bryta ner en cell inkluderar:

- Osmotisk membranruptur

- Enzymatisk nedbrytning av cellväggen

- Solubilisering av membran

- Med tvättmedel

- Med alkalibehandling

Fasta tillståndstekniker, även kända som mekaniska metoder, innebär att man utnyttjar hur DNA interagerar med ett fast substrat. Genom att välja en pärla eller molekyl som DNA:t kommer att binda till men analyten inte gör, är det möjligt att separera de två. Exempel på fastfasextraktionstekniker inklusive användning av kiseldioxid och magnetiska pärlor.

Magnetisk pärlextraktion förklaras

Den magnetiska pärlextraktionsmetoden
Potentialen för extraktion med hjälp av magnetiska pärlor erkändes först i ett amerikanskt patent inlämnat av Trevor Hawkins, för forskningsinstitutionen Whitehead Institute. Detta patent erkände att det var möjligt att extrahera genetiskt material genom att binda dem till en fast bärare, som kan vara en magnetisk pärla. Principen är att du använder en mycket funktionaliserad magnetisk pärla som det genetiska materialet kommer att binda till, som sedan kan separeras från supernatanten genom att applicera en magnetisk kraft på utsidan av kärlet som håller provet.

Varför använda magnetisk pärlextraktion?
Teknik för magnetisk pärlextraktion blir allt vanligare, på grund av den potential som den har för snabba och effektiva extraktionsprocedurer. På senare tid har det skett utvecklingar av högfunktionaliserade magnetiska pärlor med lämpliga buffertsystem, vilket har möjliggjort automatisering av nukleinsyraextraktion och ett arbetsflöde som är mycket resurslätt och kostnadseffektivt. Dessutom involverar extraktionsmetoder för magnetiska pärlor inte centrifugeringsstegen som kan orsaka skjuvkrafter som bryter upp längre bitar av DNA. Detta innebär att längre DNA-strängar förblir intakta, vilket är viktigt vid genomiktestning.