Hur man pipetterar små volymer med handhållna manuella pipetter

Eftersom mer fokus läggs på att minska reagenser och kostnader, är mindre volymer efterfrågade, t.ex. för beredning av PCR Mastermix eller enzymreaktioner. Men pipettering av små volymer från 0,2 – 5 µL ställer nya utmaningar för pipettering noggrannhet och precision. Följande punkter är viktiga:

1. Pipett- och spetsstorlek: Välj alltid pipetten med lägsta möjliga nominella volym och minsta spets för att hålla luftkudden så liten som möjligt. När du pipetterar t.ex. 1 µL, välj en 0,25 – 2,5 µL pipett och matchande spets istället för en 1 – 10 µL pipett.
2. Kalibrering och underhåll: Det är viktigt att dina pipetter är korrekt kalibrerade och underhållna. Små justeringar och trasiga delar på en pipett leder till en massiv ökning av systematiska och slumpmässiga felvärden. En kalibrering enligt ISO 8655 ska utföras en gång per år.
3. Positiva förskjutningspipetter: Kontrollera om du har en positiv förskjutningspipett med ett lågt volymintervall i ditt labb. Generellt sett leder användningen av denna typ av pipett till ett bättre pipetteringsresultat vad gäller noggrannhet och precision än med klassiska luftkuddepipetter.
4. Försök att använda större volymer: Du kan överväga att späda ditt prov för att pipettera större volymer med samma kvantitet i den slutliga reaktionen. Detta kan minska pipetteringsfel med mycket små provvolymer.

Utöver ett bra verktyg måste forskaren ha en mycket bra pipetteringsteknik. Var särskilt uppmärksam på följande steg:

1. Spetsfäste: Kläm inte fast pipetten på spetsen eftersom detta kan skada den fina spetsänden och orsaka att vätskestrålen omdirigeras eller skada öppningen. Använd endast lätt tryck när du fäster en spets och använd en pipett med en fjäderbelastad spetskon.
2. Hålla pipetten: Håll inte pipetten i handen medan du väntar på centrifugen, cyklern etc. Pipettens insida kommer att värmas upp och leda till att luftkudden expanderar, vilket resulterar i avvikelser från den inställda volymen vid pipettering.
3. Förvätning: Befuktningen av luften inuti spetsen och pipetten förbereder spetsen för provet och undviker avdunstning vid aspiration av överföringsvolymen.
4. Vertikal aspiration: Detta är mycket viktigt vid hantering av små volymer för att undvika kapilläreffekten som uppstår när pipetten hålls i vinkel.
5. Nedsänkningsdjup: Sänk ned spetsen så lite som möjligt för att förhindra att vätska kommer in i spetsen på grund av kapilläreffekten. Tumregel: Ju mindre spets och volym, desto lägre nedsänkningsdjup. Vi rekommenderar max 2 mm vid pipettering av små volymer.
6. Dispensering vid 45° vinkel: Optimalt utflöde av vätskan garanteras när pipetten hålls i en 45° vinkel.
7. Kontakt med kärlväggen eller vätskeytan: Små volymer kan endast dispenseras korrekt när spetsen hålls mot kärlväggen eller nedsänks i vätska. Även den sista droppen från spetsen kan dispenseras exakt.
8. Utblåsning: En utblåsning är obligatorisk efter utmatning av små volymer för att dispensera även den sista droppen vätska som finns i spetsen. Utblåsningen bör även utföras mot kärlväggen. Var noga med att inte föra in luftbubblor i provet när du gör en utblåsning på vätskeytan.