Цриовиалссе обично користе за криогено складиштење ћелијских линија и других критичних биолошких материјала, у Дјуоровим посудама напуњеним течним азотом.

Постоји неколико фаза које су укључене у успешно очување ћелија у течном азоту. Док је основни принцип споро замрзавање, тачна техника која се користи зависи од типа ћелије и криопротектанта који се користи. Постоји неколико безбедносних разматрања и најбољих пракси које треба узети у обзир приликом складиштења ћелија на тако ниским температурама.

Овај пост има за циљ да да преглед начина на који се криовијале чувају у течном азоту.

Шта су Цриовиалс

Криовиале су мале бочице са поклопцем дизајниране за чување узорака течности на екстремно ниским температурама. Они обезбеђују да ћелије сачуване у криопротектанту не дођу у директан контакт са течним азотом, минимизирајући ризик од прелома ћелија, док и даље имају користи од екстремног ефекта хлађења течног азота.

Бочице су обично доступне у различитим запреминама и дизајну – могу бити са унутрашњим или спољашњим навојем са равним или заобљеним дном. Доступни су и стерилни и нестерилни формати.

Ко користиЦировиалсза складиштење ћелија у течном азоту

Низ НХС и приватних лабораторија, као и истраживачких институција специјализованих за банкарство крви пупчаника, биологију епителних ћелија, имунологију и биологију матичних ћелија користе криопијале за криопрезервацију ћелија.

Ћелије сачуване на овај начин укључују Б и Т ћелије, ЦХО ћелије, хематопоетске матичне и прогениторне ћелије, хибридоме, цревне ћелије, макрофаге, мезенхималне матичне и прогениторне ћелије, моноците, мијелом, НК ћелије и плурипотентне матичне ћелије.

Преглед како чувати криопијале у течном азоту

Криопрезервација је процес који чува ћелије и друге биолошке конструкције хлађењем на веома ниске температуре. Ћелије се могу чувати у течном азоту годинама без губитка виталности ћелије. Ово је преглед примењених процедура.

Припрема ћелије

Тачан метод за припрему узорака ће варирати у зависности од типа ћелије, али генерално, ћелије се сакупљају и центрифугирају да би се развила пелета богата ћелијама. Ова пелета се затим ресуспендује у супернатанту помешаном са криопротектантом или медијумом за криопрезервацију.

Цриопресерватион Медиум

Овај медијум се користи за очување ћелија у окружењима ниских температура којима ће бити изложени инхибирањем формирања интра и екстрацелуларних кристала, а тиме и ћелијске смрти. Њихова улога је да обезбеде безбедно, заштитно окружење за ћелије и ткива током процеса замрзавања, складиштења и одмрзавања.

Медијум као што је свеже замрзнута плазма (ФФП), раствор хепаринизованог плазмалита или раствори без серума, без животињских компоненти се меша са криопротектантима као што је диметил сулфоксид (ДМСО) или глицерол.

Пелета поновног течног узорка се дели у аликвоте у полипропиленске крио-овиоке као нпрБиомедицинска компанија Сузхоу Аце Цриогениц Стораге Виалс.

Важно је да се криоовиале не препуне јер ће то повећати ризик од пуцања и могућег ослобађања садржаја (1).

Контролисана стопа замрзавања

Генерално, спора контролисана стопа замрзавања се користи за успешно криопрезервацију ћелија.

Након што се узорци аликвотирају у криогене бочице, они се стављају на влажни лед или у фрижидер на 4℃ и поступак замрзавања почиње у року од 5 минута. Као општи водич, ћелије се хладе брзином од -1 до -3 у минути (2). Ово се постиже коришћењем програмабилног хладњака или стављањем бочица у изоловану кутију смештену у замрзивач са контролисаном брзином од –70°Ц до –90°Ц.

Пребаците у течни азот

Замрзнуте криогене бочице се затим преносе у резервоар са течним азотом на неодређено време под условом да се одржава температура нижа од -135 ℃.

Ове ултра-ниске температуре се могу добити урањањем у течну или пару фазу азота.

Течна или парна фаза?

Познато је да складиштење у течној фази азота одржава хладну температуру са апсолутном конзистенцијом, али се често не препоручује из следећих разлога:

• Потреба за великим количинама (дубином) течног азота што представља потенцијалну опасност. Опекотине или гушење због тога представљају прави ризик.
• Документовани случајеви унакрсне контаминације инфективним агенсима као што су аспергилус, хеп Б и ширење вируса путем медијума са течним азотом (2,3)
• Потенцијал да течни азот процури у бочице током потапања. Када се извади из складишта и загреје на собну температуру, азот се брзо шири. Сходно томе, бочица може да се разбије када се извади из складишта течног азота, стварајући опасност и од летећих крхотина и од излагања садржају (1, 4).

Из ових разлога, складиштење на ултра ниским температурама је најчешће у парној фази азота. Када се узорци морају чувати у течној фази, треба користити специјализоване цриофлек цеви.

Недостатак парне фазе је што може доћи до вертикалног температурног градијента који резултира температурним флуктуацијама између -135 ℃ и -190 ℃. Ово захтева пажљиво и марљиво праћење нивоа течног азота и температурних варијација (5).

Многи произвођачи препоручују да су криовиале погодне за складиштење до -135℃ или за употребу само у парној фази.

Одмрзавање ваших криоконзервираних ћелија

Процедура одмрзавања је стресна за замрзнуту културу, а потребно је правилно руковање и техника да би се обезбедила оптимална одрживост, опоравак и функционалност ћелија. Тачни протоколи одмрзавања ће зависити од специфичних типова ћелија. Међутим, брзо одмрзавање се сматра стандардним за:

• Смањите сваки утицај на опоравак ћелија
• Помозите да се смањи време излагања раствореним материјама присутним у медијуму за замрзавање
• Минимизирајте било какву штету рекристализацијом леда

За одмрзавање узорака обично се користе водена купатила, купке са перлама или специјализовани аутоматизовани инструменти.

Најчешће се 1 ћелијска линија одмрзава у исто време 1-2 минута, нежним мешањем у воденом купатилу на 37℃ док у бочици не остане само мало леда пре него што се исперу у претходно загрејаном медијуму за раст.

За неке ћелије као што су ембриони сисара, споро загревање је од суштинског значаја за њихов опстанак.

Ћелије су сада спремне за ћелијску културу, ћелијску изолацију, или у случају хематопоетских матичних ћелија – студије одрживости да би се гарантовао интегритет матичних ћелија донатора пре мијелоаблативне терапије.

Нормална пракса је да се узимају мали аликвоти претходно опраног узорка који се користе за бројање ћелија да би се одредиле концентрације ћелија за постављање у културу. Затим можете проценити резултате поступака изолације ћелија и одредити виталност ћелије.

Најбоље праксе за складиштење криопијала

Успешно криопрезервација узорака ускладиштених у крио-овиокама зависи од многих елемената у протоколу, укључујући правилно складиштење и вођење евиденције.

• Поделите ћелије између локација за складиштење– Ако запремине дозвољавају, поделите ћелије између бочица и чувајте их на одвојеним локацијама да бисте смањили ризик од губитка узорка услед кварова опреме.
• Спречити унакрсну контаминацију– Одлучите се за стерилне криогене бочице за једнократну употребу или аутоклав пре следеће употребе
• Користите бочице одговарајуће величине за своје ћелије– бочице долазе у распону запремина између 1 и 5 мл. Избегавајте препуњавање бочица да бисте смањили ризик од пуцања.
• Изаберите криогене бочице са унутрашњим или спољашњим навојем– Неки универзитети препоручују бочице са унутрашњим навојем за мере безбедности – оне такође могу да спрече контаминацију током пуњења или када се чувају у течном азоту.
• Спречите цурење- Користите заптивке са двоструким убризгавањем уливене у поклопац са навојем или О-прстенове да бисте спречили цурење и контаминацију.
• Користите 2Д бар кодове и бочице са етикетама– да би се обезбедила следљивост, бочице са великим површинама за писање омогућавају да свака бочица буде адекватно обележена. 2Д бар кодови могу помоћи у управљању складиштењем и чувању записа. Капе означене бојама су корисне за лакшу идентификацију.
• Адекватно одржавање складиштења- Да би се осигурало да се ћелије не изгубе, посуде за складиштење треба да стално прате температуру и нивое течног азота. Аларми треба да буду постављени да упозоравају кориснике на грешке.

Мере предострожности

Течни азот је постао уобичајена пракса у савременим истраживањима, али носи ризик од озбиљних повреда ако се користи неправилно.

Треба носити одговарајућу личну заштитну опрему (ППЕ) како би се смањио ризик од промрзлина, опекотина и других штетних инцидената при руковању течним азотом. Носите

• Криогене рукавице
• Лабораторијски мантил
• Штитник за цело лице отпоран на ударце који такође покрива врат
• Ципеле са затвореним прстима
• Пластична кецеља отпорна на прскање

Фрижидере са течним азотом треба поставити у добро проветрене просторе како би се смањио ризик од гушења – азот који је изашао испарава и истискује атмосферски кисеоник. Продавнице великих количина треба да имају алармне системе за мало кисеоника.

Рад у пару при руковању течним азотом је идеалан и његову употребу ван уобичајеног радног времена треба забранити.

Криовиалије за подршку вашем току рада

Компанија Сузхоу Аце Биомедицал нуди широк избор производа који задовољавају ваше потребе за криопрезервацијом за различите типове ћелија. Портфолио укључује низ епрувета, као и низ стерилних криоовиа.

Наши криоови су:

• Лабораторијски поклопац на навој 0,5 мЛ 1,5 мЛ 2,0 мЛ Криовијалне криогене бочице са конусним дном криоцев са заптивком

  ● 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл спецификација, са сукњом или без сукње
  ● Доступни су конусни или самостојећи дизајн, стерилни или нестерилни
  ● Цеви са навојним поклопцем су направљене од медицинског полипропилена
  ● ПП бочице за криотубе могу се више пута замрзнути и одмрзнути
  ● Дизајн спољне капице може смањити вероватноћу контаминације током третмана узорка.
  ● Криогене цеви са поклопцем Универзални навоји за употребу
  ● Цеви одговарају већини уобичајених ротора
  ● Криогене цеви са о-прстеновима одговарају стандардним кутијама за замрзиваче од 1 инча и 2 инча, 48, 81, 96 и 100 бунара
  ● Може се аутоклавирати до 121°Ц и замрзнути до -86°Ц

  ДЕО БР	МАТЕРИЈАЛ	ВОЛУМЕ	ЦАПЦОЛОР	ПЦС/БАГ	БАГС/ЦАСЕ
  АЦТ05-БЛ-Н	PP	0.5МЛ	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10
  АЦТ15-БЛ-Н	PP	1.5МЛ	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10
  АЦТ15-БЛ-НВ	PP	1.5МЛ	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10
  АЦТ20-БЛ-Н	PP	2.0МЛ	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10