Стандардизација процеса укључује њихову оптимизацију и накнадно успостављање и хармонизацију, омогућавајући дугорочне оптималне перформансе – независно од корисника. Стандардизација обезбеђује резултате високог квалитета, као и њихову поновљивост и упоредивост.
Циљ (класичног) ПЦР-а је стварање поузданог и поновљивог резултата. За одређене примене, принос одПЦР производтакође је релевантан. За ове реакције, мора се водити рачуна да узорци нису угрожени и да ПЦР радни ток остане стабилан. Конкретно, ово значи минимизирање уношења контаминација које могу довести до лажно позитивних или лажно негативних резултата или чак инхибирати ПЦР реакцију. Штавише, реакциони услови треба да буду што је могуће идентични за сваки појединачни узорак у оквиру серије и да се такође могу пренети на наредне реакције (исте методе). Ово се односи на састав реакција као и на тип контроле температуре у циклусу. Корисничке грешке, наравно, треба избегавати колико год је то могуће.
У наставку ћемо показати изазове са којима се сусрећу током припреме и током трајања ПЦР-а – и приступе решењима који постоје у погледу инструмената и потрошног материјала који се користе за стандардизацију ПЦР токова.
Припрема реакције
Распоређивање реакционих компоненти у ПЦР посуде, односно плоче, укључује више изазова који се морају превазићи:
Услови реакције
Тачно и прецизно дозирање појединачних компоненти је неопходно када се циљају на најидентичније могуће услове реакције. Поред добре технике пипетирања, одабир правог алата је критичан. ПЦР мастер мешавине често садрже супстанце које повећавају вискозитет или стварају пену. Током процеса пипетирања, они доводе до значајног влажењаврхови пипете, чиме се смањује тачност пипетирања. Употреба система за директно дозирање или алтернативних врхова пипета који су мање склони влажењу може побољшати тачност и прецизност процеса пипетирања.
Контаминације
Током процеса дозирања, стварају се аеросоли који, ако им се дозволи да дођу до унутрашњости пипете, могу потенцијално контаминирати други узорак током следећег корака пипетирања. Ово се може спречити коришћењем врхова филтера или система директног померања.
Потрошни материјал као нпрсавети, посуде и плоче које се користе у ПЦР радном току не смеју да садрже супстанце које компромитују узорак или лажирају резултат. То укључује ДНК, ДНазе, РНазе и ПЦР инхибиторе, као и компоненте које потенцијално могу да се излуже из материјала током реакције – супстанце познате као излуживање.
Корисничка грешка
Што се више узорака обради, већи је ризик од грешке. Лако се може десити да се узорак пипетира у погрешну посуду или погрешну бунар. Овај ризик се може значајно смањити лако уочљивим обележавањем бунара. Кроз аутоматизацију корака дозирања, „људски фактор“, тј. грешке и варијације везане за корисника, минимизирани су, чиме се повећава поновљивост, посебно у случају малих реакционих запремина. Ово захтева плоче довољне димензионалне стабилности да би се користиле у радној станици. Приложени бар кодови пружају додатну машинску читљивост, што поједностављује праћење узорка током целог процеса.
Програмирање термоциклера
Програмирање инструмента може се показати као дуготрајно и подложно грешкама. Различите карактеристике ПЦР термалног циклуса раде заједно да поједноставе овај корак процеса и, што је најважније, да га учине безбедним:
Лако руковање и добро вођење корисника су основа ефикасног програмирања. На основу ове основе, администрација корисника заштићена лозинком спречиће друге кориснике да мењају сопствене програме. Ако се користи више циклуса (истог типа), корисно је ако се програм може директно пренети са једног инструмента на други преко УСБ-а или везе. Рачунарски софтвер омогућава централну и безбедну администрацију програма, корисничких права и докумената на рачунару.
ПЦР рун
Током рада, ДНК се умножава у реакционом суду, где сваки узорак треба да буде подвргнут идентичним, конзистентним реакционим условима. Следећи аспекти су релевантни за процес:
Контрола температуре
Одлична прецизност у контроли температуре и хомогеност циклусног блока су основа за равномерно температурно кондиционирање свих узорака. Висок квалитет грејних и расхладних елемената (пелтиерови елементи), као и начин на који су они повезани са блоком, одлучујући су фактори који ће одредити ризик од температурних неслагања познатих као „ефекат ивице“
Испаравање
Концентрације појединачних реакционих компоненти не би требало да се мењају током реакције услед испаравања. Иначе, могуће је да врло малоПЦР производможе бити генерисана или уопште ниједна. Стога је кључно минимизирати испаравање тако што ћете осигурати сигурно заптивање. У овом случају, загрејани поклопац термоциклера и печат посуде раде руку под руку. Доступне су различите опције заптивања заПЦР плоче (линк: Заптивни чланак), при чему се најбоље заптивање постиже кроз топлотно заптивање. Други затварачи такође могу бити прикладни, све док се контактни притисак поклопца циклера може подесити на изабрану заптивку.
Успостављена је стандардизација процеса како би се осигурали тачни и поновљиви резултати на дужи рок. Ово укључује редовно одржавање опреме како би се осигурало да је увек у добром радном стању. Сав потрошни материјал треба да буде константно високог квалитета у свим произведеним серијама, а њихова поуздана доступност мора бити загарантована.
Време поста: 29.11.2022