Увод
Шта је екстракција нуклеинске киселине?
Најједноставније речено, екстракција нуклеинске киселине је уклањање РНК и/или ДНК из узорка и сав вишак који није потребан. Процес екстракције изолује нуклеинске киселине из узорка и даје их у облику концентрованог елуата, без разблаживача и загађивача који би могли да утичу на било коју другу примену.
Примене екстракције нуклеинске киселине
Пречишћене нуклеинске киселине се користе у мноштву различитих примена, у распону од више различитих индустрија. Здравство је можда област у којој се највише користи, са пречишћеном РНК и ДНК потребним за мноштво различитих сврха тестирања.
Примене екстракције нуклеинске киселине у здравству укључују:
– Секвенцирање следеће генерације (НГС)
- СНП генотипизација заснована на амплификацији
- Генотипизација заснована на низу
- Варење рестрикцијским ензимима
- Анализе коришћењем модификованих ензима (нпр. лигација и клонирање)
Постоје и друга поља изван здравствене заштите у којима се користи екстракција нуклеинске киселине, укључујући, али не ограничавајући се на тестирање очинства, форензику и геномику.
Кратка историја екстракције нуклеинске киселине
Екстракција ДНКдатира у далеку прошлост, са првом познатом изолацијом коју је извео швајцарски лекар по имену Фридрих Мишер 1869. Мишер се надао да ће решити основне принципе живота одређивањем хемијског састава ћелија. Након неуспеха са лимфоцитима, успео је да добије сирови преципитат ДНК из леукоцита пронађених у гноју на одбаченим завојима. Он је то урадио додавањем киселине, а затим алкалије у ћелију да напусти ћелијску цитоплазму, а затим је развио протокол за одвајање ДНК од других протеина.
Након Мишеровог револуционарног истраживања, многи други научници су наставили да унапређују и развијају технике за изоловање и пречишћавање ДНК. Едвин Џозеф Кон, научник о протеинима, развио је многе технике за пречишћавање протеина током Другог светског рата. Он је био одговоран за изоловање фракције серумског албумина из крвне плазме, што је важно за одржавање осмотског притиска у крвним судовима. Ово је било кључно за одржавање војника у животу.
Године 1953. Френсис Крик, заједно са Розалиндом Френклин и Џејмсом Вотсоном, утврдио је структуру ДНК, показујући да се састоји од два ланца дугих ланаца нуклеотида нуклеинске киселине. Ово револуционарно откриће отворило је пут Меселсону и Сталу, који су били у стању да развију протокол центрифугирања са градијентом густине како би изоловали ДНК из бактерије Е. Цоли док су демонстрирали полуконзервативну репликацију ДНК током свог експеримента 1958. године.
Технике екстракције нуклеинске киселине
Које су 4 фазе екстракције ДНК?
Све методе екстракције се своде на исте основне кораке.
Целл Дисруптион. Ова фаза, такође позната као ћелијска лиза, укључује разбијање ћелијског зида и/или ћелијске мембране, како би се ослободиле унутарћелијске течности које садрже нуклеинске киселине од интереса.
Уклањање нежељених остатака. Ово укључује мембранске липиде, протеине и друге нежељене нуклеинске киселине које могу ометати низводне примене.
Изолација. Постоји више различитих начина за изоловање нуклеинских киселина од интереса из очишћеног лизата који сте креирали, а који спадају у две главне категорије: на бази раствора или у чврстом стању (погледајте следећи одељак).
Концентрација. Након што су нуклеинске киселине изоловане од свих осталих загађивача и разблаживача, оне су представљене у висококонцентрованом елуату.
Две врсте екстракције
Постоје две врсте екстракције нуклеинске киселине – методе засноване на раствору и методе у чврстом стању. Метода заснована на раствору позната је и као метода хемијске екстракције, јер укључује употребу хемикалија за разбијање ћелије и приступ нуклеинском материјалу. Ово може бити коришћење или органских једињења као што су фенол и хлороформ, или мање штетних и стога више препоручених неорганских једињења као што су протеиназа К или силика гел.
Примери различитих метода хемијске екстракције за разбијање ћелије укључују:
- Осмотска руптура мембране
- Ензимско варење ћелијског зида
- Солубилизација мембране
- Са детерџентима
- Са алкалним третманом
Технике чврстог стања, познате и као механичке методе, укључују искоришћавање начина на који ДНК интерагује са чврстим супстратом. Одабиром куглице или молекула за које ће се ДНК везати, али аналит неће, могуће је раздвојити то двоје. Примери техника екстракције у чврстој фази укључујући коришћење силицијум диоксида и магнетних перли.
Објашњено вађење магнетних перли
Метода екстракције магнетних перли
Потенцијал за екстракцију коришћењем магнетних перли први пут је препознат у америчком патенту који је поднео Тревор Хокинс за истраживачку институцију Института Вајтхед. Овај патент је признао да је могуће екстраховати генетски материјал везивањем за чврсти носач, који би могао бити магнетна перла. Принцип је да користите високо функционализовану магнетну куглицу на коју ће се везати генетски материјал, који се затим може одвојити од супернатанта применом магнетне силе на спољашњу страну посуде која држи узорак.
Зашто користити екстракцију магнетних перли?
Технологија екстракције магнетних куглица постаје све заступљенија, због потенцијала који има за брзе и ефикасне процедуре екстракције. У новије време дошло је до развоја високо функционализованих магнетних перли са одговарајућим пуфер системима, који су омогућили аутоматизацију екстракције нуклеинске киселине и радни ток који је веома лак и економичан. Такође, методе екстракције магнетних куглица не укључују кораке центрифугирања који могу изазвати силе смицања које разбијају дуже делове ДНК. То значи да дужи ланци ДНК остају нетакнути, што је важно у тестирању геномике.
Време поста: 25.11.2022