Иако би у теорији, један молекул шаблона било довољно, знатно веће количине ДНК се обично користе за класични ПЦР, на пример, до 1 кг геномског сисара ДНК и само 1 пг плазмид ДНК. Оптимални износ у великој мери зависи од броја примерака циљне секвенце, као и на њеној сложености.
Ако се користи врло мало шаблона, потребно је одговарајуће повећање броја циклуса појачања за добијање довољне количине производа. Так полимераза која се користи за већину ПЦР експеримената не садржи функцију корекције (3'-5 "активност егзонуклеасе); Дакле, грешке које се јављају током појачања не могу се исправити. Што је већи број циклуса, то ће превладава појачано појачавање погрешног производа. Ако је, с друге стране, количина шаблона превисока, вероватноћа прајмера жарући на друге (не стотину процената бесплатних) секвенци, као и формирање димерних прајмера, што ће резултирати појачавањем нуспроизводи. У многим случајевима ДНК је изолован од ћелијских култура или од микроорганизама и накнадно се користи као ПЦР образац. Након пречишћавања, потребно је одредити концентрацију ДНК-а како би се могло дефинисати запремину која је потребна за ПЦР подешавање. Иако електрофореза Агаросе Гел може послужити за доношење процене, ова метода је далеко од тачне. УВ-ВИС Спектрофотометрија је основана као златни стандард за квантификацију нуклеинских киселина; Ова директна и самим тим једноставна и брза метода мери апсорбанција узорка на 260 нМ, а концентрација се израчунава уз помоћ фактора конверзије.
Ако је концентрација ДНК врло ниска, међутим (<1 μг / мЛ ДСДНА), или ако је контаминирана супстанцама које такође апсорбују у опсегу од 260 НМ (нпр. РНА, протеина, соли), ова метода ће достићи своја ограничења. У случају врло ниских концентрација, очитавања ће ускоро постати превише нетачна да би била од користи, а контаминације ће довести до (понекад огромне) прецењености стварне вредности. У овом случају, квантификација која користи флуоресценцију може представити алтернативу. Ова техника се заснива на употреби флуоресцентне боје која се посебно односи на ДСДНА само комплекс који садржи нуклеинску киселину и бојицу је узбуђен светлошћу и накнадно ће емитовати светлост незнатне веће таласне дужине. Овде је интензитет флуоресцентног сигнала пропорционалан количини ДНК, а за утврђивање концентрације оцењује се у односу на стандардну кривуљу. Предности ове методе одмарају се на специфичности обвезнице, што искључује спољни утицаји који су уведени контаминацијом, као и на добијеној способности детектирања врло ниских концентрација ДНК-а. Подобност било које методе углавном зависи од концентрације узорка и чистоће; У многим случајевима је чак и препоручљиво да се на паралелно примењује обе методе.
Вријеме поште: Нов-30-2022