Për reaksione të suksesshme të amplifikimit, është e nevojshme që përbërësit individualë të reaksionit të jenë të pranishëm në përqendrimin e duhur në çdo preparat. Përveç kësaj, është e rëndësishme që të mos ketë ndotje.
Sidomos kur duhen ngritur shumë reaksione, është krijuar që të përgatitet një e ashtuquajtur master mix në vend që të vendoset me pipetë secili reagent veçmas në secilën enë. Përzierjet e para-konfiguruara janë të disponueshme në treg, në të cilat shtohen vetëm përbërës specifikë për mostrën (primer) dhe ujë. Përndryshe, përzierja master mund të përgatitet vetë. Në të dy variantet, përzierja shpërndahet në çdo enë PCR pa shabllon dhe mostra individuale e ADN-së shtohet veçmas në fund.
Përdorimi i një përzierjeje master ka disa përparësi: Së pari, numri i hapave të vetëm të pipetimit zvogëlohet. Në këtë mënyrë minimizohen si rreziku i gabimeve të përdoruesit gjatë vendosjes me pipet ashtu edhe rreziku i kontaminimit dhe natyrisht kursehet koha. Në parim, saktësia e pipetimit është gjithashtu më e lartë, pasi dozohen vëllime më të mëdha. Kjo është e lehtë për t'u kuptuar kur kontrolloni të dhënat teknike të pipetave: Sa më i vogël të jetë vëllimi i dozuar, aq më të larta mund të jenë devijimet. Fakti që të gjitha preparatet vijnë nga e njëjta enë ndikon pozitivisht në homogjenitet (nëse përzihen mirë). Kjo gjithashtu përmirëson riprodhueshmërinë e eksperimenteve.
Gjatë përgatitjes së përzierjes kryesore, duhet të shtohet të paktën 10 % vëllim shtesë (p.sh. nëse nevojiten 10 përgatitje, llogaritni në bazë të 11), në mënyrë që edhe ena e fundit të mbushet siç duhet. Në këtë mënyrë, mund të kompensohen pasaktësitë (të lehta) të pipetimit dhe efekti i humbjes së mostrës gjatë dozimit të solucioneve që përmbajnë detergjent. Detergjentët përmbahen në solucione enzimash si polimerazat dhe përzierjet kryesore, duke shkaktuar formimin e shkumës dhe mbetjet në sipërfaqen e brendshme të normales.majat e pipetës.
Në varësi të aplikimit dhe llojit të lëngut që do të shpërndahet, duhet të zgjidhet teknika e saktë e tubimit (1) dhe të zgjidhet pajisja e duhur. Për solucionet që përmbajnë detergjentë, rekomandohet një sistem me zhvendosje të drejtpërdrejtë ose të ashtuquajturat majat e pipetës "me mbajtje të ulët" si një alternativë për pipetat me jastëk ajri. Efekti iMajë ACE PIPETTEbazohet në një sipërfaqe veçanërisht hidrofobike. Lëngjet që përmbajnë detergjentë nuk lënë një film mbetje brenda dhe jashtë, në mënyrë që humbja e tretësirës të minimizohet.
Përveç dozimit të saktë të të gjithë përbërësve, është gjithashtu e rëndësishme që të mos ketë ndotje të preparateve. Nuk mjafton përdorimi i materialeve harxhuese me pastërti të lartë, sepse procesi i nxjerrjes me pipetë në një pipetë me jastëk ajri mund të prodhojë aerosole që mbeten në pipetë. ADN-ja që mund të përmbahet në aerosol mund të transferohet nga një mostër në tjetrën në hapin e mëposhtëm të pipetimit dhe kështu të çojë në kontaminim. Sistemet e zhvendosjes direkte të përmendura më sipër mund të minimizojnë gjithashtu këtë rrezik. Për pipetat me jastëk ajri ka kuptim të përdoren majat e filtrit për të mbrojtur konin e pipetës duke mbajtur spërkatjet, aerosolet dhe biomolekulat.
Koha e postimit: Dhjetor-06-2022