Kriovialetzakonisht përdoren për ruajtjen kriogjenike të linjave qelizore dhe materialeve të tjera kritike biologjike, në dewar të mbushura me azot të lëngshëm.

Ka disa faza të përfshira në ruajtjen e suksesshme të qelizave në azot të lëngshëm. Ndërsa parimi bazë është një ngrirje e ngadaltë, teknika e saktë e përdorur varet nga lloji i qelizës dhe krioprojtësi i përdorur. Ka disa konsiderata sigurie dhe praktika më të mira që duhen marrë parasysh kur ruhen qelizat në temperatura kaq të ulëta.

Ky postim synon të japë një përmbledhje të mënyrës sesi kriovialet ruhen në azot të lëngshëm.

Çfarë janë Cryovials

Kriovialet janë shishe të vogla me kapak, të dizajnuara për ruajtjen e mostrave të lëngshme në temperatura jashtëzakonisht të ulëta. Ato sigurojnë që qelizat e ruajtura në krioprotekt të mos vijnë në kontakt të drejtpërdrejtë me azotin e lëngshëm, duke minimizuar rrezikun e frakturave qelizore ndërsa ende përfitojnë nga efekti ftohës ekstrem i azotit të lëngshëm.

Shishkët zakonisht janë të disponueshëm në një sërë vëllimesh dhe modelesh - ato mund të jenë të filetuara brenda ose jashtë me funde të sheshta ose të rrumbullakosura. Ekzistojnë gjithashtu formate sterile dhe josterile.

Kush përdorCyrovialspër të ruajtur qelizat në azot të lëngshëm

Një sërë laboratorësh të NHS dhe private, si dhe institucione kërkimore të specializuara në bankingun e gjakut të kordonit, biologjinë e qelizave epiteliale, imunologjinë dhe biologjinë e qelizave staminale përdorin kriovialet për të kriopservuar qelizat.

Qelizat e ruajtura në këtë mënyrë përfshijnë qelizat B dhe T, qelizat CHO, qelizat burimore dhe paraardhëse hematopoietike, hibridomat, qelizat intestinale, makrofagët, qelizat burimore dhe paraardhëse mezenkimale, monocitet, mieloma, qelizat NK dhe qelizat burimore pluripotente.

Përmbledhje e Si të ruani kriovialet në azot të lëngshëm

Kriopservimi është një proces që ruan qelizat dhe konstruktet e tjera biologjike duke i ftohur ato në temperatura shumë të ulëta. Qelizat mund të ruhen në azot të lëngshëm për vite pa humbur qëndrueshmërinë e qelizave. Ky është një përmbledhje e procedurave të përdorura.

Përgatitja e qelizave

Metoda e saktë për përgatitjen e mostrave do të ndryshojë në varësi të llojit të qelizës, por në përgjithësi, qelizat mblidhen dhe centrifugohen për të zhvilluar një pelet të pasur me qeliza. Ky pelet më pas risuspendohet në supernatantin e përzier me krioprotektant ose një mjedis krioprojtës.

Medium për kriopruajtje

Ky medium përdoret për të ruajtur qelizat në mjediset me temperaturë të ulët që do t'i nënshtrohen duke penguar formimin e kristaleve brenda dhe jashtëqelizore dhe si rrjedhim vdekjen e qelizave. Roli i tyre është të sigurojnë një mjedis të sigurt, mbrojtës për qelizat dhe indet gjatë proceseve të ngrirjes, ruajtjes dhe shkrirjes.

Një medium i tillë si plazma e ngrirë e freskët (FFP), tretësirë ​​plazmaliti i heparinizuar ose solucione pa serum, pa përbërës shtazorë, përzihet me krioprojtës si dimetil sulfoksidi (DMSO) ose glicerina.

Peleti i mostrës së ri-likuiduar ndahet në kriovialë polipropileni si p.shKompania biomjekësore Suzhou Ace Cryogenic Storage Vials.

Është e rëndësishme që të mos mbushen shumë kriovialet pasi kjo do të rrisë rrezikun e plasaritjes dhe lirimin e mundshëm të përmbajtjes (1).

Shkalla e kontrolluar e ngrirjes

Në përgjithësi, një shkallë e ngadaltë e kontrolluar e ngrirjes përdoret për kriopruajtjen e suksesshme të qelizave.

Pasi mostrat janë ndarë në shishe kriogjenike, ato vendosen në akull të lagësht ose në një frigorifer 4℃ dhe procedura e ngrirjes fillon brenda 5 minutash. Si një udhëzues i përgjithshëm, qelizat ftohen me një shpejtësi prej -1 deri në -3 në minutë (2). Kjo arrihet duke përdorur një ftohës të programueshëm ose duke vendosur shishka në një kuti të izoluar të vendosur në një ngrirës me shpejtësi të kontrolluar nga -70°C deri në -90°C.

Transferimi në azot të lëngshëm

Shishkat kriogjenike të ngrira më pas transferohen në një rezervuar me azot të lëngshëm për periudha të pacaktuara me kusht që të ruhet një temperaturë më e vogël se -135℃.

Këto temperatura ultra të ulëta mund të arrihen duke u zhytur në azot në fazën e lëngshme ose të avullit.

Faza e lëngshme apo e avullit?

Dihet se ruajtja në azot të fazës së lëngët ruan temperaturën e ftohtë me konsistencë absolute, por shpesh nuk rekomandohet për arsyet e mëposhtme:

• Nevoja për vëllime (thellësi) të mëdha të azotit të lëngshëm që është një rrezik potencial. Djegiet ose asfiksia për shkak të kësaj është një rrezik real.
• Raste të dokumentuara të kontaminimit të kryqëzuar nga agjentë infektivë si aspergillus, hep B dhe përhapje virale nëpërmjet mjedisit të azotit të lëngshëm (2,3)
• Mundësia e rrjedhjes së azotit të lëngshëm në shishe gjatë zhytjes. Kur hiqet nga ruajtja dhe ngrohet në temperaturën e dhomës, azoti zgjerohet me shpejtësi. Rrjedhimisht, shishja mund të thyhet kur hiqet nga ruajtja e azotit të lëngshëm, duke krijuar një rrezik si nga mbeturinat fluturuese ashtu edhe nga ekspozimi ndaj përmbajtjes (1, 4).

Për këto arsye, ruajtja në temperaturë ultra të ulët është më së shpeshti në azotin e fazës së avullit. Kur mostrat duhet të ruhen në fazën e lëngshme, duhet të përdoren tuba të specializuar krofleks.

Ana negative e fazës së avullit është se mund të ndodhë një gradient vertikal i temperaturës që rezulton në luhatje të temperaturës midis -135℃ dhe -190℃. Kjo kërkon monitorim të kujdesshëm dhe të zellshëm të niveleve të azotit të lëngshëm dhe ndryshimeve të temperaturës (5).

Shumë prodhues rekomandojnë që kriovialet të jenë të përshtatshme për ruajtje deri në -135℃ ose për përdorim vetëm në fazën e avullit.

Shkrirja e qelizave tuaja të kriopservuara

Procedura e shkrirjes është stresuese për një kulturë të ngrirë, dhe trajtimi dhe teknika e duhur kërkohet për të siguruar qëndrueshmëri, rikuperim dhe funksionalitet optimal të qelizave. Protokollet e sakta të shkrirjes do të varen nga llojet specifike të qelizave. Megjithatë, shkrirja e shpejtë konsiderohet standarde për:

• Zvogëloni çdo ndikim në rikuperimin qelizor
• Ndihmoni në reduktimin e kohës së ekspozimit ndaj substancave të tretshme të pranishme në median ngrirëse
• Minimizoni çdo dëmtim nga rikristalizimi i akullit

Për shkrirjen e mostrave zakonisht përdoren banja me ujë, banja me rruaza ose instrumente të automatizuara të specializuara.

Më shpesh, 1 linjë qelizore shkrihet në të njëjtën kohë për 1-2 minuta, duke e rrotulluar lehtë në një banjë uji 37 ℃ derisa të mbetet vetëm pak akull në shishkë përpara se të lahen në një mjedis të rritjes të ngrohur paraprakisht.

Për disa qeliza si embrionet e gjitarëve, ngrohja e ngadaltë është thelbësore për mbijetesën e tyre.

Qelizat tani janë gati për kulturën e qelizave, izolimin e qelizave ose në rastin e qelizave staminale hematopoietike – studime të qëndrueshmërisë për të garantuar integritetin e qelizave burimore të donatorëve përpara terapisë mieloablative.

Është praktikë normale që të merren pjesë të vogla të mostrës së paralarë të përdorur për të kryer numërimin e qelizave për të përcaktuar përqendrimet e qelizave për vendosje në kulturë. Më pas mund të vlerësoni rezultatet e procedurave të izolimit të qelizave dhe të përcaktoni qëndrueshmërinë e qelizave.

Praktikat më të mira për ruajtjen e kriovialeve

Kriopservimi i suksesshëm i mostrave të ruajtura në kriovialë varet nga shumë elementë në protokoll, duke përfshirë ruajtjen e duhur dhe mbajtjen e shënimeve.

• Ndani qelizat midis vendeve të ruajtjes– Nëse vëllimet e lejojnë, ndani qelizat midis flakoneve dhe ruajini ato në vende të veçanta për të zvogëluar rrezikun e humbjes së mostrës për shkak të dështimeve të pajisjeve.
• Parandaloni kontaminimin e kryqëzuar– Zgjedhni shishka kriogjenike sterile me përdorim të vetëm ose autoklava përpara përdorimit të mëvonshëm
• Përdorni shishka me madhësi të përshtatshme për qelizat tuaja– flakonet vijnë në një gamë vëllimesh midis 1 dhe 5 ml. Shmangni mbushjen e tepërt të shisheve për të zvogëluar rrezikun e plasaritjes.
• Zgjidhni shishe kriogjenike me fileto të brendshme ose të jashtme– Shishat me fileto të brendshme rekomandohen nga disa universitete për masa sigurie – ato gjithashtu mund të parandalojnë kontaminimin gjatë mbushjes ose kur ruhen në azot të lëngshëm.
• Parandalimi i rrjedhjeve- Përdorni vula me dy injektime të derdhura në kapakun e vidhos ose unazat O për të parandaluar rrjedhjen dhe kontaminimin.
• Përdorni barkode 2D dhe etiketoni shishkat– për të siguruar gjurmueshmërinë, shishet me sipërfaqe të mëdha shkrimi mundësojnë që çdo shishe të jetë etiketuar siç duhet. Barkodet 2D mund të ndihmojnë me menaxhimin e ruajtjes dhe mbajtjen e të dhënave. Kapelet e koduara me ngjyra janë të dobishme për identifikim më të lehtë.
• Mirëmbajtje adekuate e ruajtjes- Për të siguruar që qelizat të mos humbasin, enët e ruajtjes duhet të monitorojnë vazhdimisht temperaturën dhe nivelet e azotit të lëngshëm. Alarmet duhet të vendosen për të paralajmëruar përdoruesit për gabime.

Masat paraprake të sigurisë

Azoti i lëngshëm është bërë praktikë e zakonshme në kërkimet moderne, por mbart rrezikun e lëndimeve serioze nëse përdoret gabimisht.

Pajisjet e duhura mbrojtëse personale (PPE) duhet të vishen për të minimizuar rrezikun e ngrirjes, djegieve dhe incidenteve të tjera të pafavorshme gjatë trajtimit të azotit të lëngshëm. Vishni

• Doreza kriogjenike
• Veshje laboratorike
• Mburojë e plotë e fytyrës rezistente ndaj goditjeve që mbulon edhe qafën
• Këpucë me majë të mbyllura
• Përparëse plastike e papërshkueshme nga spërkatjet

Frigoriferët me azot të lëngshëm duhet të vendosen në zona të ajrosura mirë për të minimizuar rrezikun e asfiksimit - azoti i dalë avullohet dhe zhvendos oksigjenin atmosferik. Dyqanet me volum të madh duhet të kenë sisteme alarmi me oksigjen të ulët.

Puna në çifte kur merret me azot të lëngshëm është ideale dhe përdorimi i tij jashtë orarit normal të punës duhet të ndalohet.

Cryovials për të mbështetur rrjedhën tuaj të punës

Kompania Suzhou Ace Biomedical ofron një përzgjedhje të gjerë produktesh që plotësojnë nevojat tuaja për kriopruajtje për lloje të ndryshme qelizash. Portofoli përfshin një sërë tubesh dhe një sërë kriovialësh sterile.

Kriovialet tona janë:

• Kapak vidhos laboratori 0.5mL 1.5mL 2.0mL Shishe kriogjenike krioviale Cryotube konike e poshtme me guarnicione

  ● Specifikimi 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, me fund ose pa fund
  ● Dizajni konik ose vetë-qëndrueshëm, steril ose josteril janë të dy në dispozicion
  ● Tubat e kapakut me vidë janë bërë nga polipropileni i klasës mjekësore
  ● Shishkët Cryotube PP mund të ngrihen dhe shkrihen në mënyrë të përsëritur
  ●Dizajni i kapakut të jashtëm mund të zvogëlojë probabilitetin e kontaminimit gjatë trajtimit të mostrës.
  ● Tuba kriogjenike me kapakë vidhosje Fije vidhosje universale për përdorim
  ● Tubat përshtaten me rotorët më të zakonshëm
  ● Tubat me unazë me tub kriogjenik përshtaten kutitë standarde të ngrirësit 1 inç dhe 2 inç, 48 pusi, 81 pusi, 96 pusi dhe 100 pusi
  ● Autoklavohet deri në 121°C dhe ngrihet deri në -86°C

  PJESA NR	MATERIALI	VËLLIMI	CAPNGJYRA	PC/BAG	ÇANTA/KASTE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 ml	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 ml	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 ml	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10