Za uspešne reakcije pomnoževanja je nujno, da so posamezne reakcijske komponente prisotne v pravilni koncentraciji v vsakem pripravku. Poleg tega je pomembno, da ne pride do kontaminacije.
Zlasti kadar je treba vzpostaviti veliko reakcij, je bilo ugotovljeno, da se pripravi tako imenovana glavna mešanica namesto pipetiranja vsakega reagenta posebej v vsako posodo. Vnaprej konfigurirane mešanice so komercialno dostopne, v katere so dodane samo komponente, specifične za vzorec (primer) in voda. Druga možnost je, da glavno mešanico pripravite sami. Pri obeh variantah se zmes porazdeli v vsako PCR posodico brez predloge in na koncu ločeno doda posamezen vzorec DNK.
Uporaba glavne mešanice ima več prednosti: Prvič, zmanjša se število posameznih korakov pipetiranja. Na ta način sta tveganje napak uporabnika med pipetiranjem in tveganje kontaminacije zmanjšana na minimum in seveda prihranjen čas. Načeloma je tudi natančnost pipetiranja večja, saj se dozirajo večje količine. To je enostavno razumeti pri preverjanju tehničnih podatkov pipet: manjša kot je dozirana prostornina, večja so lahko odstopanja. Na homogenost pozitivno vpliva dejstvo, da so vsi pripravki iz iste posode (če so dobro premešani). To tudi izboljša ponovljivost poskusov.
Pri pripravi glavne mešanice je treba dodati vsaj 10 % dodatnega volumna (npr. če je potrebnih 10 pripravkov, izračunajte na podlagi 11), tako da se tudi zadnja posoda pravilno napolni. Na ta način lahko kompenziramo (rahle) netočnosti pipetiranja in učinek izgube vzorca pri doziranju raztopin, ki vsebujejo detergent. Detergenti so vsebovani v encimskih raztopinah, kot so polimeraze in glavne mešanice, kar povzroča nastajanje pene in ostanke na notranji površini običajnihkonice za pipete.
Glede na aplikacijo in vrsto tekočine, ki jo je treba dozirati, je treba izbrati pravilno tehniko pipetiranja (1) in izbrati ustrezno opremo. Za raztopine, ki vsebujejo detergente, se priporoča sistem neposrednega izpodrivanja ali tako imenovane konice pipet z nizkim zadrževanjem kot alternativa za pipete z zračno blazino. UčinekKonica pipete ACEtemelji na posebej hidrofobni površini. Tekočine, ki vsebujejo detergente, ne puščajo ostankov na notranji in zunanji strani, tako da je izguba raztopine čim manjša.
Poleg natančnega odmerjanja vseh sestavin je pomembno tudi, da ne pride do kontaminacije pripravkov. Ne zadostuje uporaba potrošnega materiala visoke čistosti, saj lahko postopek pipetiranja v pipeti z zračno blazino proizvede aerosole, ki ostanejo v pipeti. DNK, ki je lahko v aerosolu, se lahko prenese iz enega vzorca v drugega v naslednjem koraku pipetiranja in tako povzroči kontaminacijo. Zgoraj omenjeni sistemi neposrednega premika lahko tudi zmanjšajo to tveganje. Za pipete z zračno blazino je smiselno uporabiti konice filtrov za zaščito stožca pipete z zadrževanjem brizganja, aerosolov in biomolekul.
Čas objave: 6. december 2022