Kriovialese običajno uporabljajo za kriogeno shranjevanje celičnih linij in drugih kritičnih bioloških materialov v dewarjih, napolnjenih s tekočim dušikom.

Uspešno ohranjanje celic v tekočem dušiku vključuje več stopenj. Medtem ko je osnovno načelo počasno zamrzovanje, je natančna uporabljena tehnika odvisna od vrste celice in uporabljenega krioprotektorja. Pri shranjevanju celic pri tako nizkih temperaturah je treba upoštevati več varnostnih pomislekov in najboljših praks.

Namen te objave je predstaviti, kako so krioviale shranjene v tekočem dušiku.

Kaj so krioviale

Krioviale so majhne viale s pokrovčkom, namenjene shranjevanju tekočih vzorcev pri izjemno nizkih temperaturah. Zagotavljajo, da celice, shranjene v krioprotektorju, ne pridejo v neposreden stik s tekočim dušikom, s čimer zmanjšajo tveganje celičnih zlomov, medtem ko imajo še vedno koristi od izjemnega hladilnega učinka tekočega dušika.

Viale so običajno na voljo v različnih volumnih in oblikah – lahko imajo notranji ali zunanji navoj z ravnim ali zaobljenim dnom. Na voljo so tudi sterilni in nesterilni formati.

Kdo uporabljaCyrovialsza shranjevanje celic v tekočem dušiku

Številni NZS in zasebni laboratoriji ter raziskovalne ustanove, specializirane za shranjevanje popkovnične krvi, biologijo epitelijskih celic, imunologijo in biologijo izvornih celic, uporabljajo krioviale za kriokonzervacijo celic.

Celice, ohranjene na ta način, vključujejo celice B in T, celice CHO, hematopoetske matične in matične celice, hibridome, črevesne celice, makrofage, mezenhimske matične in matične celice, monocite, mielom, NK celice in pluripotentne matične celice.

Pregled shranjevanja kriovial v tekočem dušiku

Krioprezervacija je postopek, ki ohranja celice in druge biološke konstrukte tako, da jih ohladi na zelo nizke temperature. Celice lahko v tekočem dušiku hranimo več let brez izgube sposobnosti preživetja celic. To je oris uporabljenih postopkov.

Priprava celic

Natančna metoda za pripravo vzorcev se bo razlikovala glede na tip celice, vendar se na splošno celice zberejo in centrifugirajo, da se razvije s celicami bogata peleta. To peleto nato resuspendiramo v supernatantu, pomešanem s krioprotektorjem ali medijem za kriokonzervacijo.

Medij za kriokonzervacijo

Ta medij se uporablja za ohranjanje celic v nizkotemperaturnih okoljih, ki jim bodo izpostavljene, tako da zavira tvorbo intra- in zunajceličnih kristalov in s tem celično smrt. Njihova vloga je zagotoviti varno, zaščitno okolje za celice in tkiva med procesi zamrzovanja, shranjevanja in odmrzovanja.

Medij, kot je sveže zamrznjena plazma (FFP), heparinizirana raztopina plazmalita ali raztopine brez seruma in živalskih komponent, se zmeša s krioprotektorji, kot je dimetil sulfoksid (DMSO) ali glicerol.

Peleto ponovno utekočinjenega vzorca alikvotiramo v polipropilenske krioviale, kot je nprBiomedicinsko podjetje Suzhou Ace Cryogenic Storage Vials.

Pomembno je, da kriovial ne napolnite preveč, saj se s tem poveča nevarnost pokanja in morebitnega izpusta vsebine (1).

Nadzorovana stopnja zamrzovanja

Na splošno se za uspešno kriokonzervacijo celic uporablja počasna nadzorovana stopnja zamrzovanja.

Ko se vzorci alikvotirajo v kriogene viale, se postavijo na moker led ali v hladilnik pri 4 °C in v 5 minutah se začne postopek zamrzovanja. Splošno vodilo je, da se celice ohlajajo s hitrostjo -1 do -3 na minuto (2). To se doseže s programirljivim hladilnikom ali z dajanjem vial v izolirano škatlo, ki je postavljena v zamrzovalnik z nadzorovano hitrostjo od –70 °C do –90 °C.

Prenesite v tekoči dušik

Zamrznjene kriogene viale se nato za nedoločen čas prenesejo v rezervoar s tekočim dušikom, pod pogojem, da se vzdržuje temperatura pod -135 ℃.

Te ultra nizke temperature je mogoče doseči s potopitvijo v dušik v tekoči ali parni fazi.

Tekoča ali parna faza?

Znano je, da shranjevanje v tekoči fazi dušika vzdržuje hladno temperaturo z absolutno konsistenco, vendar se pogosto ne priporoča iz naslednjih razlogov:

• Potreba po velikih količinah (globini) tekočega dušika, ki je potencialna nevarnost. Opekline ali zadušitev zaradi tega predstavljajo resnično tveganje.
• Dokumentirani primeri navzkrižne kontaminacije s povzročitelji okužb, kot so aspergillus, hep B in virusi, ki se širijo prek medija s tekočim dušikom (2,3)
• Možnost uhajanja tekočega dušika v viale med potapljanjem. Ko ga vzamemo iz skladišča in segrejemo na sobno temperaturo, se dušik hitro razširi. Posledično se lahko viala razbije, ko jo vzamete iz skladišča s tekočim dušikom, kar povzroči nevarnost tako zaradi letečih drobcev kot zaradi izpostavljenosti vsebini (1, 4).

Zaradi teh razlogov je shranjevanje pri ultra nizkih temperaturah najpogosteje v dušiku v parni fazi. Kadar morajo biti vzorci shranjeni v tekoči fazi, je treba uporabiti specializirane cryoflex cevi.

Slaba stran parne faze je, da lahko pride do navpičnega temperaturnega gradienta, ki povzroči temperaturna nihanja med -135 ℃ in -190 ℃. To zahteva skrbno in skrbno spremljanje ravni tekočega dušika in temperaturnih nihanj (5).

Številni proizvajalci priporočajo, da so krioviale primerne za shranjevanje do -135 ℃ ali samo za uporabo v parni fazi.

Odtaljevanje kriokonzerviranih celic

Postopek odmrzovanja je stresen za zamrznjeno kulturo, zato je potrebno pravilno ravnanje in tehnika, da se zagotovi optimalna sposobnost preživetja, okrevanje in funkcionalnost celic. Natančni protokoli odmrzovanja bodo odvisni od specifičnih vrst celic. Vendar se hitro odmrzovanje šteje za standardno za:

• Zmanjša kakršen koli vpliv na obnovo celic
• Pomagajte skrajšati čas izpostavljenosti raztopljenim snovem v zamrzovalnem mediju
• Zmanjšajte morebitno škodo s prekristalizacijo ledu

Za odmrzovanje vzorcev se običajno uporabljajo vodne kopeli, kopeli s kroglicami ali specializirani avtomatizirani instrumenti.

Najpogosteje se 1 celična linija naenkrat odmrzne 1-2 minuti z nežnim vrtenjem v vodni kopeli pri 37 °C, dokler v viali ne ostane le majhen košček ledu, preden se sperejo v predhodno segretem rastnem mediju.

Za nekatere celice, kot so zarodki sesalcev, je počasno segrevanje bistveno za preživetje.

Celice so zdaj pripravljene za celično kulturo, izolacijo celic ali v primeru hematopoetskih matičnih celic – študije viabilnosti, ki zagotavljajo celovitost izvornih celic darovalcev pred mieloablativno terapijo.

Običajna praksa je, da se vzamejo majhni alikvoti predhodno opranega vzorca, ki se uporablja za štetje celic za določitev celičnih koncentracij za nasaditev v kulturo. Nato lahko ocenite rezultate postopkov izolacije celic in določite sposobnost preživetja celic.

Najboljše prakse za shranjevanje kriovial

Uspešno krioprezerviranje vzorcev, shranjenih v kriovialah, je odvisno od številnih elementov v protokolu, vključno s pravilnim shranjevanjem in vodenjem evidenc.

• Razdeli celice med lokacijami za shranjevanje– Če prostornine dovoljujejo, celice razdelite na viale in jih shranite na ločenih lokacijah, da zmanjšate tveganje izgube vzorca zaradi okvar opreme.
• Preprečite navzkrižno kontaminacijo– Pred nadaljnjo uporabo se odločite za sterilne kriogene viale za enkratno uporabo ali avtoklav
• Za svoje celice uporabite ustrezno velike viale– viale so na voljo v različnih volumnih med 1 in 5 ml. Izogibajte se prenapolnjenju vial, da zmanjšate tveganje za pokanje.
• Izberite kriogene viale z notranjim ali zunanjim navojem– Nekatere univerze zaradi varnostnih ukrepov priporočajo viale z notranjim navojem – preprečijo lahko tudi kontaminacijo med polnjenjem ali shranjevanjem v tekočem dušiku.
• Preprečite puščanje- Uporabite dvojno vbrizgana tesnila, oblikovana v navojni pokrovček ali O-tesnila, da preprečite puščanje in kontaminacijo.
• Uporabite 2D črtne kode in označite viale– za zagotovitev sledljivosti viale z velikimi pisalnimi površinami omogočajo, da je vsaka viala ustrezno označena. 2D črtne kode lahko pomagajo pri upravljanju shranjevanja in vodenju evidenc. Barvno označeni pokrovčki so uporabni za lažjo identifikacijo.
• Ustrezno vzdrževanje skladišča- Da zagotovite, da se celice ne izgubijo, morajo posode za shranjevanje stalno spremljati temperaturo in ravni tekočega dušika. Namestiti je treba alarme, ki uporabnike opozarjajo na napake.

Varnostni ukrepi

Tekoči dušik je postal običajna praksa v sodobnih raziskavah, vendar ob nepravilni uporabi predstavlja nevarnost resnih poškodb.

Nositi je treba ustrezno osebno zaščitno opremo (PPE), da zmanjšate tveganje ozeblin, opeklin in drugih neželenih dogodkov pri ravnanju s tekočim dušikom. Nosite

• Kriogene rokavice
• Laboratorijski plašč
• Na udarce odporen ščitnik za celoten obraz, ki pokriva tudi vrat
• Zaprti čevlji
• Plastični predpasnik, odporen na škropljenje

Hladilnike s tekočim dušikom je treba postaviti v dobro prezračevane prostore, da zmanjšate tveganje zadušitve – uhajajoči dušik izhlapi in izpodriva atmosferski kisik. Trgovine z velikim obsegom morajo imeti alarmne sisteme za nizko vsebnost kisika.

Delo v parih pri rokovanju s tekočim dušikom je idealno in njegova uporaba izven običajnega delovnega časa bi morala biti prepovedana.

Krioviale za podporo vašemu delovnemu toku

Podjetje Suzhou Ace Biomedical ponuja širok izbor izdelkov, ki ustrezajo vašim potrebam po kriokonzervaciji za različne vrste celic. Portfelj vključuje vrsto epruvet, pa tudi vrsto sterilnih kriovial.

Naše krioviale so:

• Laboratorijska navojna kapica 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Kriovialne kriogene viale Kriocev s stožčastim dnom in tesnilom

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikacije, z ali brez krila
  ● Na voljo sta stožčasta ali samostoječa oblika, sterilna ali nesterilna
  ● Cevi z navojnim pokrovčkom so narejene iz medicinskega polipropilena
  ● Viale PP Cryotube lahko večkrat zamrznete in odmrznete
  ● Zunanji dizajn pokrovčka lahko zmanjša verjetnost kontaminacije med obdelavo vzorca.
  ● Kriogene cevi z navojnim pokrovom Univerzalni navoji za uporabo
  ● Cevi ustrezajo večini običajnih rotorjev
  ● O-ring cevi za kriogene cevi se prilegajo standardnim 1-palčnim in 2-palčnim, 48 vdolbinam, 81 vdolbinam, 96 vdolbinam in 100 vdolbinam za zamrzovanje
  ● Avtoklavirano do 121°C in zamrznjeno do -86°C

  DEL ŠT	MATERIAL	GLASNOST	CAPBARVA	PCS/TORBA	TORBICE/KOVČEK
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10