Standardizacija procesov vključuje njihovo optimizacijo in kasnejšo vzpostavitev ter harmonizacijo, ki omogoča dolgoročno optimalno delovanje – neodvisno od uporabnika. Standardizacija zagotavlja kakovostne rezultate ter njihovo ponovljivost in primerljivost.
Cilj (klasičnega) PCR je generiranje zanesljivega in ponovljivega rezultata. Za nekatere aplikacije je izkoristekPCR produktje tudi relevantno. Pri teh reakcijah je treba paziti, da vzorci niso ogroženi in da potek dela PCR ostane stabilen. Natančneje, to pomeni zmanjšanje vnosa kontaminacij, ki bi lahko povzročile lažno pozitivne ali lažno negativne rezultate ali celo zavirale reakcijo PCR. Poleg tega morajo biti reakcijski pogoji čim bolj enaki za vsak posamezen vzorec v seriji in prenosljivi tudi na naslednje reakcije (iste metode). To se nanaša na sestavo reakcij kot tudi na vrsto nadzora temperature v ciklerju. Uporabniškim napakam se je seveda treba čim bolj izogibati.
Spodaj bomo prikazali izzive, s katerimi se srečujemo med pripravo in med potekom PCR – ter pristope k rešitvam, ki obstajajo v zvezi z instrumenti in potrošnim materialom, ki se uporabljajo za standardizacijo delovnih tokov PCR.
Priprava reakcije
Doziranje reakcijskih komponent v PCR-posode oziroma plošče vključuje številne izzive, ki jih je treba premagati:
Pogoji reakcije
Natančno in natančno doziranje posameznih komponent je nepogrešljivo, če želimo doseči čim bolj enake reakcijske pogoje. Poleg dobre tehnike pipetiranja je ključnega pomena izbira pravega orodja. Glavne mešanice PCR pogosto vsebujejo snovi, ki povečujejo viskoznost ali ustvarjajo peno. Med postopkom pipetiranja ti vodijo do znatnega omočenjakonice za pipete, kar zmanjša natančnost pipetiranja. Uporaba sistemov za neposredno odmerjanje ali alternativnih konic pipet, ki so manj nagnjene k močenju, lahko izboljša točnost in natančnost postopka pipetiranja.
Kontaminacije
Med postopkom razdeljevanja nastanejo aerosoli, ki lahko, če jim dovolimo, da dosežejo notranjost pipete, potencialno kontaminirajo drug vzorec med naslednjim korakom pipetiranja. To je mogoče preprečiti z uporabo filtrirnih konic ali sistemov neposrednega izpodrivanja.
Potrošni material kot nprnasveti, posode in plošče, ki se uporabljajo v delovnem procesu PCR, ne smejo vsebovati snovi, ki ogrozijo vzorec ali ponaredijo rezultat. Ti vključujejo DNA, DNaze, RNaze in inhibitorje PCR ter komponente, ki se lahko med reakcijo izpirajo iz materiala – snovi, znane kot izlužljive snovi.
Uporabniška napaka
Več vzorcev kot je obdelanih, večje je tveganje napake. Lahko se zgodi, da vzorec pipetiramo v napačno posodo ali napačno vdolbinico. To tveganje je mogoče znatno zmanjšati z dobro opaznimi oznakami vodnjakov. Z avtomatizacijo dozirnih korakov je "človeški dejavnik", tj. napake in variacije, povezane z uporabnikom, minimaliziran, s čimer se poveča ponovljivost, zlasti v primeru majhnih reakcijskih volumnov. To zahteva plošče z zadostno dimenzijsko stabilnostjo za uporabo v delovni postaji. Priložene črtne kode zagotavljajo dodatno strojno berljivost, kar poenostavlja sledenje vzorcev skozi celoten proces.
Programiranje termociklerja
Programiranje instrumenta se lahko izkaže za dolgotrajno in nagnjeno k napakam. Različne funkcije termičnega ciklerja PCR delujejo skupaj, da poenostavijo ta korak postopka in, kar je najpomembnejše, naredijo varnega:
Enostavno upravljanje in dobro vodenje uporabnika sta osnova učinkovitega programiranja. Na tej osnovi bo skrbništvo uporabnikov, zaščiteno z geslom, preprečilo, da bi drugi uporabniki spreminjali lastne programe. Če je v uporabi več ciklerjev (istega tipa), je koristno, če se program lahko prenese neposredno iz enega instrumenta v drugega prek USB-ja ali povezave. Računalniška programska oprema omogoča centralno in varno upravljanje programov, uporabniških pravic in dokumentov na računalniku.
Potek PCR
Med postopkom se DNK pomnoži v reakcijski posodi, kjer je treba vsak vzorec izpostaviti enakim, doslednim reakcijskim pogojem. Za postopek so pomembni naslednji vidiki:
Nadzor temperature
Odlična natančnost pri nadzoru temperature in homogenost ciklirnega bloka sta osnova za enakomerno temperaturno kondicioniranje vseh vzorcev. Visoka kakovost grelnih in hladilnih elementov (peltierjevih elementov) ter način, na katerega so ti povezani z blokom, so odločilni dejavniki, ki bodo določali tveganje temperaturnih odstopanj, znanih kot "edge effect"
Izhlapevanje
Koncentracije posameznih reakcijskih komponent se med potekom reakcije ne smejo spreminjati zaradi izhlapevanja. Sicer je možno, da zelo maloPCR produktse lahko ustvarijo ali pa sploh ne. Zato je ključnega pomena zmanjšati izhlapevanje z zagotavljanjem varnega tesnjenja. V tem primeru ogrevan pokrov termociklerja in tesnilo posode delujeta z roko v roki. Na voljo so različne možnosti tesnjenjaPCR plošče (povezava: članek o tesnjenju), pri čemer je najboljše tesnjenje doseženo s toplotnim varjenjem. Primerna so lahko tudi druga zapirala, če je kontaktni pritisk pokrova ciklerja mogoče prilagoditi izbranemu tesnilu.
Vzpostavljena je standardizacija postopkov, da se dolgoročno zavarujejo točni in ponovljivi rezultati. To vključuje redno vzdrževanje opreme, da se zagotovi, da je vedno v dobrem delovnem stanju. Vsi potrošni materiali morajo biti dosledno visoke kakovosti v vseh proizvedenih serijah, njihova zanesljiva razpoložljivost pa mora biti zagotovljena.
Čas objave: 29. nov. 2022