Uvod
Kaj je ekstrakcija nukleinske kisline?
Najenostavneje povedano, ekstrakcija nukleinske kisline je odstranitev RNA in/ali DNA iz vzorca in vsega presežka, ki ni potreben. Postopek ekstrakcije izolira nukleinske kisline iz vzorca in jih pridobi v obliki koncentriranega eluata, brez razredčil in kontaminantov, ki bi lahko vplivali na nadaljnje aplikacije.
Uporaba ekstrakcije nukleinskih kislin
Očiščene nukleinske kisline se uporabljajo v številnih različnih aplikacijah, ki segajo v več različnih industrij. Zdravstveno varstvo je morda področje, kjer se največ uporablja, saj sta prečiščeni RNK in DNK potrebni za množico različnih namenov testiranja.
Uporabe ekstrakcije nukleinske kisline v zdravstvu vključujejo:
- Sekvenciranje naslednje generacije (NGS)
- Genotipizacija SNP na podlagi pomnoževanja
- Genotipizacija na osnovi nizov
- Prebava z restrikcijskimi encimi
- Analize z uporabo modificirajočih encimov (npr. Ligacija in kloniranje)
Poleg zdravstvene oskrbe obstajajo tudi druga področja, kjer se uporablja ekstrakcija nukleinske kisline, vključno, vendar ne omejeno na testiranje očetovstva, forenziko in genomiko.
Kratka zgodovina ekstrakcije nukleinske kisline
Ekstrakcija DNKsega daleč nazaj, saj je prvo znano izolacijo izvedel švicarski zdravnik po imenu Friedrich Miescher leta 1869. Miescher je upal, da bo z določitvijo kemične sestave celic razrešil temeljna načela življenja. Po neuspehu z limfociti mu je uspelo pridobiti surovo oborino DNK iz levkocitov, ki so jih našli v gnoju na zavrženih povojih. To je naredil tako, da je celici dodal kislino in nato alkalijo, da je zapustila celično citoplazmo, nato pa je razvil protokol za ločevanje DNK od drugih proteinov.
Po Miescherjevi prelomni raziskavi so številni drugi znanstveniki napredovali in razvijali tehnike za izolacijo in čiščenje DNK. Edwin Joseph Cohn, beljakovinski znanstvenik, je razvil številne tehnike za čiščenje beljakovin med drugo svetovno vojno. Bil je odgovoren za izolacijo serumske albuminske frakcije krvne plazme, ki je pomembna za vzdrževanje osmotskega tlaka v krvnih žilah. To je bilo ključnega pomena za ohranjanje preživetja vojakov.
Leta 1953 je Francis Crick skupaj z Rosalind Franklin in Jamesom Watsonom določil strukturo DNK in pokazal, da je sestavljena iz dveh verig dolgih verig nukleotidov nukleinskih kislin. To prelomno odkritje je utrlo pot Meselsonu in Stahlu, ki sta lahko razvila protokol centrifugiranja z gradientom gostote za izolacijo DNK iz bakterije E. Coli, ko sta med svojim poskusom leta 1958 prikazala polkonzervativno replikacijo DNK.
Tehnike ekstrakcije nukleinskih kislin
Katere so 4 stopnje ekstrakcije DNK?
Vse metode ekstrakcije se skrčijo na iste temeljne korake.
Motnje celic. Ta stopnja, znana tudi kot celična liza, vključuje razgradnjo celične stene in/ali celične membrane, da se sprostijo znotrajcelične tekočine, ki vsebujejo nukleinske kisline, ki nas zanimajo.
Odstranjevanje neželenih ostankov. To vključuje membranske lipide, beljakovine in druge neželene nukleinske kisline, ki lahko motijo nadaljnje aplikacije.
Izolacija. Obstaja več različnih načinov za izolacijo nukleinskih kislin, ki vas zanimajo, iz očiščenega lizata, ki ste ga ustvarili, ki spadajo med dve glavni kategoriji: na osnovi raztopine ali v trdnem stanju (glejte naslednji razdelek).
koncentracija. Ko so nukleinske kisline izolirane od vseh drugih kontaminantov in razredčil, so predstavljene v visoko koncentriranem eluatu.
Dve vrsti ekstrakcije
Obstajata dve vrsti ekstrakcije nukleinske kisline – metode na osnovi raztopine in metode v trdnem stanju. Metoda, ki temelji na raztopini, je znana tudi kot metoda kemične ekstrakcije, saj vključuje uporabo kemikalij za razgradnjo celice in dostop do nukleinskega materiala. To je lahko uporaba organskih spojin, kot sta fenol in kloroform, ali manj škodljivih in zato bolj priporočljivih anorganskih spojin, kot sta proteinaza K ali silikagel.
Primeri različnih metod kemične ekstrakcije za razgradnjo celice vključujejo:
- Osmotski razpok membrane
- Encimska prebava celične stene
- Solubilizacija membrane
- Z detergenti
- Z alkalno obdelavo
Tehnike v trdnem stanju, znane tudi kot mehanske metode, vključujejo izkoriščanje medsebojnega delovanja DNK s trdnim substratom. Z izbiro kroglice ali molekule, na katero se bo DNK vezala, analit pa ne, je mogoče to dvoje ločiti. Primeri tehnik ekstrakcije v trdni fazi, vključno z uporabo silicijevega dioksida in magnetnih kroglic.
Razloženo pridobivanje magnetnih kroglic
Metoda magnetne ekstrakcije kroglic
Potencial ekstrakcije z uporabo magnetnih kroglic je bil prvič prepoznan v ameriškem patentu, ki ga je vložil Trevor Hawkins za raziskovalno ustanovo Whitehead Institute. Ta patent je potrdil, da je mogoče pridobiti genetski material z vezavo na trden nosilec, ki je lahko magnetna kroglica. Načelo je, da uporabite visoko funkcionalno magnetno kroglico, na katero se bo vezal genetski material, ki ga je nato mogoče ločiti od supernatanta z uporabo magnetne sile na zunanji strani posode, v kateri je vzorec.
Zakaj uporabljati ekstrakcijo z magnetnimi kroglicami?
Tehnologija ekstrakcije z magnetnimi kroglicami postaja vse bolj razširjena zaradi potenciala, ki ga ima za hitre in učinkovite postopke ekstrakcije. V zadnjem času je prišlo do razvoja visokofunkcionalnih magnetnih kroglic z ustreznimi puferskimi sistemi, ki so omogočili avtomatizacijo ekstrakcije nukleinske kisline in potek dela, ki je zelo lahek in stroškovno učinkovit. Poleg tega metode ekstrakcije magnetnih kroglic ne vključujejo korakov centrifugiranja, ki lahko povzročijo strižne sile, ki razbijejo daljše dele DNK. To pomeni, da daljše verige DNK ostanejo nedotaknjene, kar je pomembno pri testiranju genomike.
Čas objave: 25. nov. 2022