Čeprav bi teoretično zadostovala ena molekula predloge, se bistveno večje količine DNK običajno uporabljajo za klasični PCR, na primer do 1 µg genomske DNK sesalcev in le 1 pg plazmidne DNK. Optimalni znesek je v veliki meri odvisen od števila kopij ciljnega zaporedja, pa tudi od njegove zapletenosti.
Če se uporablja zelo malo predloge, bo za pridobitev zadostne količine izdelka potrebno ustrezno povečanje števila amplifikacijskih ciklov. Polimeraza TAQ, ki se uporablja za večino poskusov PCR, nima funkcije korekcije (3'-5 'eksonukleazna aktivnost); Tako napak, ki se pojavljajo med amplifikacijo, ni mogoče popraviti. Večje kot je število ciklov, bolj razširjena bo amplifikacija napačnega izdelka. Če je na drugi strani količina predloge previsoka, se bo povečala verjetnost, da bodo prajmerji, ki se žarijo drugim (ne stoodstotno brezplačnim) zaporedjem, in nastajanje dimerjev temeljnih premazov stranski proizvodi. V mnogih primerih je DNK izolirana iz celičnih kultur ali iz mikroorganizmov in se nato uporablja kot PCR predloga. Po čiščenju je treba določiti koncentracijo DNK, da lahko določite prostornino, ki je potreben za nastavitev PCR. Medtem ko lahko agarozna gel elektroforeza služi za oceno, ta metoda še zdaleč ni natančna. UV-vis spektrofotometrija je bila ugotovljena kot zlati standard za količinsko določitev nukleinskih kislin; Ta neposredna in zato enostavna in hitra merila metode absorpcije vzorca pri 260 nm, koncentracija pa se izračuna s pomočjo faktorja pretvorbe.
Če je koncentracija DNK zelo nizka (<1 µg/ml dsDNA) ali je onesnažena s snovmi, ki absorbirajo tudi v območju 260 nm (npr. RNA, beljakovine, soli), bo ta metoda dosegla svoje omejitve. V primeru zelo nizkih koncentracij bodo odčitki kmalu postali preveč netočni, da bi jih lahko uporabili, kontaminacije pa bodo privedle do (včasih ogromno) precenjevanja dejanske vrednosti. V tem primeru lahko kvantifikacija z uporabo fluorescence predstavlja alternativo. Ta tehnika temelji na uporabi fluorescentnega barvila, ki se veže posebej na dsDNA, samo kompleks, ki obsega nukleinsko kislino in barvilo, vzbuja svetlobo, nato pa bo oddajala svetlobo nekoliko večje valovne dolžine. Tu je intenzivnost fluorescentnega signala sorazmerna s količino DNK, za določitev koncentracije pa se ocenjuje glede na standardno krivuljo. Prednosti te metode temeljijo na specifičnosti vezi, ki izključuje zunanje vplive, ki jih uvede kontaminacija, in tudi na posledično sposobnost zaznavanja zelo nizkih koncentracij DNK. Primernost katere koli metode je odvisna predvsem od koncentracije vzorca in čistosti; V mnogih primerih je morda celo priporočljivo, da vzporedno uporabimo obe metodi.
Čas objave: november-30-2022