Pre úspešné amplifikačné reakcie je potrebné, aby jednotlivé reakčné zložky boli v každom prípravku prítomné v správnej koncentrácii. Okrem toho je dôležité, aby nedošlo k žiadnej kontaminácii.
Najmä vtedy, keď je potrebné pripraviť veľa reakcií, bolo zavedené pripraviť takzvanú hlavnú zmes namiesto pipetovania každého činidla samostatne do každej nádoby. Komerčne dostupné sú vopred nakonfigurované zmesi, do ktorých sa pridávajú iba zložky špecifické pre vzorku (primer) a voda. Prípadne si master mix môžete pripraviť sami. V oboch variantoch sa zmes rozdelí do každej PCR nádobky bez templátu a na konci sa samostatne pridá jednotlivá vzorka DNA.
Použitie hlavnej zmesi má niekoľko výhod: Po prvé, počet jednotlivých krokov pipetovania sa zníži. Týmto spôsobom sa minimalizuje riziko užívateľských chýb pri pipetovaní, ako aj riziko kontaminácie a samozrejme sa šetrí čas. V zásade je presnosť pipetovania tiež vyššia, pretože sa dávkujú väčšie objemy. To je ľahko pochopiteľné pri kontrole technických údajov pipiet: Čím menší je dávkovaný objem, tým vyššie môžu byť odchýlky. Skutočnosť, že všetky prípravky pochádzajú z rovnakej nádoby, má pozitívny vplyv na homogenitu (ak sú dobre premiešané). To tiež zlepšuje reprodukovateľnosť experimentov.
Pri príprave základnej zmesi by sa malo pridať aspoň 10 % objemu navyše (napr. ak je potrebných 10 príprav, vypočítajte na základe 11), aby sa aj posledná nádoba správne naplnila. Týmto spôsobom možno kompenzovať (mierne) nepresnosti pipetovania a vplyv straty vzorky pri dávkovaní roztokov obsahujúcich detergenty. Čistiace prostriedky sú obsiahnuté v enzýmových roztokoch, ako sú polymerázy a hlavné zmesi, čo spôsobuje tvorbu peny a zvyšky na vnútornom povrchu normálnehošpičky pipiet.
V závislosti od aplikácie a typu kvapaliny, ktorá sa má dávkovať, by sa mala zvoliť správna technika pipetovania (1) a vhodné zariadenie. Pre roztoky obsahujúce detergenty sa ako alternatíva k pipetám so vzduchovým vankúšikom odporúča systém priameho vytesnenia alebo takzvané špičky pipiet s nízkou retenciou. ÚčinokŠpička ACE PIPETTEje založený na obzvlášť hydrofóbnom povrchu. Kvapaliny obsahujúce čistiace prostriedky nezanechávajú zvnútra ani zvonka zvyškový film, takže stratu roztoku možno minimalizovať.
Okrem presného dávkovania všetkých zložiek je dôležité aj to, aby nedošlo ku kontaminácii prípravkov. Nestačí použiť spotrebný materiál vysokej čistoty, pretože proces pipetovania v pipete so vzduchovým vankúšom môže produkovať aerosóly, ktoré zostávajú v pipete. DNA, ktorá môže byť obsiahnutá v aerosóle, sa môže v nasledujúcom pipetovacom kroku preniesť z jednej vzorky do ďalšej, a tak viesť ku kontaminácii. Vyššie uvedené systémy priameho posunu môžu tiež minimalizovať toto riziko. Pri pipetách so vzduchovým vankúšikom má zmysel používať filtračné špičky na ochranu kužeľa pipety tým, že zadržia rozstrek, aerosóly a biomolekuly.
Čas odoslania: 06. december 2022