Pre úspešné amplifikačné reakcie je potrebné, aby jednotlivé reakčné zložky boli prítomné v správnej koncentrácii v každej príprave. Okrem toho je dôležité, aby nedošlo k žiadnej kontaminácii.
Najmä vtedy, keď je potrebné nastaviť veľa reakcií, bolo zavedené, aby pripravili takzvanú hlavnú zmes namiesto pipetovania každé činidlá osobitne do každej nádoby. Predkonfigurované zmesi sú komerčne dostupné, do ktorých sa pridávajú iba vzorky špecifické komponenty (primer) a voda. Alternatívne môže byť hlavná zmes pripravená sami. V obidvoch variantoch je zmes distribuovaná do každej nádoby PCR bez šablóny a jednotlivá vzorka DNA sa na konci pridá osobitne.
Použitie hlavnej mixu má niekoľko výhod: po prvé, počet krokov s jedným pipetom sa zníži. Týmto spôsobom sa minimalizuje riziko chýb používateľov počas pipetovania a riziko kontaminácie a samozrejme sa ušetrí čas. Presnosť pipetovania je v zásade vyššia, pretože sa dávajú väčšie objemy. Toto je ľahko pochopiteľné pri kontrole technických údajov o pipete: čím menší je dávkovaný objem, tým vyššia je odchýlky. Skutočnosť, že všetky prípravky pochádzajú z rovnakej nádoby, má pozitívny vplyv na homogenitu (ak je dobre zmiešaná). To tiež zlepšuje reprodukovateľnosť experimentov.
Pri príprave hlavnej zmesi by sa mal pridať najmenej 10 % extra objem (napr. Ak je potrebných 10 prípravkov, vypočítajte na základe 11), takže aj posledná nádoba vyplnila správne. Týmto spôsobom je možné kompenzovať (mierne) nepresnosti pipetovania nepresnosti a účinok straty vzorky pri dávkovaní detergentových roztokov. Detergenty sú obsiahnuté v enzýmových roztokoch, ako sú polymerázy a hlavné zmesi, čo spôsobuje tvorbu peny a zvyšky na vnútornom povrchu normálneho povrchutipy na pipetu.
V závislosti od aplikácie a typu tekutiny, ktorá sa má vydávať, by sa mala zvoliť správna technika pipetovania (1) a vybraných príslušných zariadení. V prípade roztokov obsahujúcich detergenty sa odporúča priamy systém posunu alebo tzv. Hroty pipety „nízkej retencie“ ako alternatíva pre pipety vzduchu vrecka. ÚčinokEso pipetkaje založený na obzvlášť hydrofóbnom povrchu. Kvapaliny obsahujúce detergenty nenechávajú zvyškový film na vnútornej a zvonku, takže stratu roztoku možno minimalizovať.
Okrem presného dávkovania všetkých komponentov je tiež dôležité, aby nedošlo k kontaminácii prípravkov. Nestačí používať spotrebný materiál s vysokou čistotou, pretože proces pipetovania vo vzduchovej vankúšovej pipette môže produkovať aerosóly, ktoré zostávajú v pipete. DNA, ktorá môže byť obsiahnutá v aerosóle, sa môže preniesť z jednej vzorky na druhú v nasledujúcom kroku pipetovania, a tak viesť ku kontaminácii. Vyššie uvedené systémy priameho vysídlenia môžu tiež minimalizovať toto riziko. V prípade pipety vzduchu má zmysel používať špičky filtra na ochranu pipetového kužeľa tým, že si zachovávajú striekanie, aerosóly a biomolekuly.
Čas príspevku: december 06-2022