Kryvialkysa bežne používajú na kryogénne skladovanie bunkových línií a iných kritických biologických materiálov v Dewarových nádobách naplnených tekutým dusíkom.

Na úspešnom uchovaní buniek v tekutom dusíku sa podieľa niekoľko fáz. Zatiaľ čo základným princípom je pomalé zmrazovanie, presná použitá technika závisí od typu bunky a použitej kryoprotektívnej látky. Pri skladovaní článkov pri tak nízkych teplotách je potrebné vziať do úvahy niekoľko bezpečnostných hľadísk a osvedčených postupov.

Cieľom tohto príspevku je poskytnúť prehľad o tom, ako sa kryoskúmavky uchovávajú v tekutom dusíku.

Čo sú Cryovials

Kryvialky sú malé ampulky s uzáverom určené na skladovanie kvapalných vzoriek pri extrémne nízkych teplotách. Zabezpečujú, aby sa bunky konzervované v kryoprotektante nedostali do priameho kontaktu s tekutým dusíkom, čím sa minimalizuje riziko bunkových zlomenín, pričom stále ťaží z extrémneho chladiaceho účinku tekutého dusíka.

Liekovky sú zvyčajne dostupné v rôznych objemoch a prevedeniach – môžu mať vnútorný alebo vonkajší závit s plochým alebo zaobleným dnom. Dostupné sú aj sterilné a nesterilné formáty.

Kto používaCyrovialsna skladovanie buniek v kvapalnom dusíku

Celý rad NHS a súkromných laboratórií, ako aj výskumné inštitúcie špecializujúce sa na bankovanie pupočníkovej krvi, biológiu epitelových buniek, imunológiu a biológiu kmeňových buniek používajú kryoskúmavky na kryokonzerváciu buniek.

Bunky konzervované týmto spôsobom zahŕňajú B a T bunky, CHO bunky, hematopoetické kmeňové a progenitorové bunky, hybridómy, črevné bunky, makrofágy, mezenchymálne kmeňové a progenitorové bunky, monocyty, myelóm, NK bunky a pluripotentné kmeňové bunky.

Prehľad ako uchovávať kryoskúmavky v tekutom dusíku

Kryokonzervácia je proces, ktorý uchováva bunky a iné biologické konštrukty ich ochladzovaním na veľmi nízke teploty. Bunky môžu byť skladované v tekutom dusíku roky bez straty životaschopnosti buniek. Toto je náčrt použitých postupov.

Príprava buniek

Presný spôsob prípravy vzoriek sa bude líšiť v závislosti od typu buniek, ale vo všeobecnosti sa bunky zbierajú a centrifugujú, aby sa vytvorila peleta bohatá na bunky. Táto peleta sa potom resuspenduje v supernatante zmiešanom s kryoprotektantom alebo kryokonzervačným médiom.

Kryokonzervačné médium

Toto médium sa používa na uchovanie buniek v nízkoteplotných prostrediach, ktorým budú vystavené, inhibíciou tvorby intracelulárnych a extracelulárnych kryštálov a tým aj bunkovej smrti. Ich úlohou je poskytnúť bezpečné, ochranné prostredie pre bunky a tkanivá počas procesov zmrazovania, skladovania a rozmrazovania.

Médium, ako je čerstvá zmrazená plazma (FFP), heparinizovaný roztok plazmylytu alebo bezsérové ​​roztoky bez živočíšnych zložiek sa zmiešajú s kryoprotektantmi, ako je dimetylsulfoxid (DMSO) alebo glycerol.

Znovu skvapalnená peleta vzorky sa alikvótne rozdelí do polypropylénových kryoskúmaviek, ako naprSpoločnosť Suzhou Ace Biomedical Cryogenic Storage Vials.

Je dôležité, aby ste kryoskúmavky nepreplnili, pretože to zvýši riziko prasknutia a možného uvoľnenia obsahu (1).

Kontrolovaná rýchlosť mrazenia

Vo všeobecnosti sa na úspešnú kryokonzerváciu buniek používa pomalá riadená rýchlosť zmrazovania.

Potom, čo sa vzorky rozdelia na alikvóty do kryogénnych fľaštičiek, umiestnia sa na mokrý ľad alebo do chladničky s teplotou 4 °C a do 5 minút sa spustí proces zmrazovania. Vo všeobecnosti sa bunky ochladzujú rýchlosťou -1 až -3 za minútu (2). To sa dosiahne pomocou programovateľného chladiča alebo umiestnením fľaštičiek do izolovanej skrinky umiestnenej v mrazničke s riadenou rýchlosťou –70 °C až –90 °C.

Presun do kvapalného dusíka

Zmrazené kryogénne liekovky sa potom prenesú do nádrže s tekutým dusíkom na neurčitý čas za predpokladu, že sa udržiava teplota nižšia ako -135 °C.

Tieto ultranízke teploty možno dosiahnuť ponorením do kvapalného alebo plynného dusíka.

Kvapalná alebo parná fáza?

Je známe, že skladovanie v kvapalnom dusíku udržuje nízku teplotu s absolútnou konzistenciou, ale často sa neodporúča z nasledujúcich dôvodov:

• Potreba veľkých objemov (hĺbok) tekutého dusíka, čo predstavuje potenciálne nebezpečenstvo. Popáleniny alebo zadusenie v dôsledku toho sú skutočným rizikom.
• Zdokumentované prípady krížovej kontaminácie infekčnými agens, ako je aspergillus, hep B a vírusové šírenie prostredníctvom média s tekutým dusíkom (2,3)
• Možnosť úniku tekutého dusíka do liekoviek počas ponorenia. Po vybratí zo skladu a zahriatí na izbovú teplotu dusík rýchlo expanduje. V dôsledku toho sa fľaštička môže rozbiť, keď sa vyberie zo skladu tekutého dusíka, čo predstavuje riziko odletujúcich úlomkov a vystavenia obsahu (1, 4).

Z týchto dôvodov sa skladovanie pri ultranízkej teplote najčastejšie uskutočňuje v dusíku v plynnej fáze. Ak sa vzorky musia skladovať v kvapalnej fáze, mali by sa použiť špeciálne kryoflexné hadičky.

Nevýhodou plynnej fázy je, že môže nastať vertikálny teplotný gradient, ktorý vedie k teplotným výkyvom medzi -135 °C a -190 °C. To si vyžaduje starostlivé a dôsledné monitorovanie hladín tekutého dusíka a teplotných zmien (5).

Mnohí výrobcovia odporúčajú, aby boli kryoskúmavky vhodné na skladovanie až do -135 °C alebo na použitie len v parnej fáze.

Rozmrazovanie vašich kryokonzervovaných buniek

Postup rozmrazovania je pre zmrazenú kultúru stresujúci a na zabezpečenie optimálnej životaschopnosti, obnovy a funkčnosti buniek je potrebná správna manipulácia a technika. Presné protokoly rozmrazovania budú závisieť od konkrétnych typov buniek. Rýchle rozmrazovanie sa však považuje za štandard pre:

• Znížte akýkoľvek vplyv na obnovu buniek
• Pomôžte skrátiť dobu expozície rozpusteným látkam prítomným v mraziacom médiu
• Minimalizujte akékoľvek poškodenie rekryštalizáciou ľadu

Na rozmrazovanie vzoriek sa bežne používajú vodné kúpele, perličkové kúpele alebo špecializované automatizované prístroje.

Najčastejšie sa 1 bunková línia rozmrazuje naraz počas 1-2 minút jemným krúživým pohybom vo vodnom kúpeli s teplotou 37 °C, kým v liekovke nezostane len malý kúsok ľadu, a potom sa premyjú v predhriatom rastovom médiu.

Pre niektoré bunky, ako sú embryá cicavcov, je pomalé otepľovanie nevyhnutné na ich prežitie.

Bunky sú teraz pripravené na kultiváciu buniek, izoláciu buniek alebo v prípade hematopoetických kmeňových buniek – štúdie životaschopnosti, aby sa zaručila integrita kmeňových buniek darcu pred myeloablačnou terapiou.

Je bežnou praxou odobrať malé alikvóty vopred premytej vzorky použitej na vykonanie počítania buniek na stanovenie koncentrácií buniek na nanesenie do kultúry. Potom môžete posúdiť výsledky postupov izolácie buniek a určiť životaschopnosť buniek.

Osvedčené postupy skladovania kryoskúmaviek

Úspešná kryokonzervácia vzoriek uložených v kryoskúmavkách závisí od mnohých prvkov v protokole vrátane správneho skladovania a vedenia záznamov.

• Rozdeľte bunky medzi miestami uloženia– Ak to objemy umožňujú, rozdeľte bunky medzi liekovky a uložte ich na oddelené miesta, aby ste znížili riziko straty vzorky v dôsledku zlyhania zariadenia.
• Zabráňte krížovej kontaminácii– Pred ďalším použitím sa rozhodnite pre jednorazové sterilné kryogénne liekovky alebo autokláv
• Použite liekovky vhodnej veľkosti pre vaše bunky– Injekčné liekovky sa dodávajú v rozsahu objemov medzi 1 a 5 ml. Vyhnite sa preplneniu liekoviek, aby ste znížili riziko prasknutia.
• Vyberte kryogénne liekovky s vnútorným alebo vonkajším závitom– Fľaštičky s vnútorným závitom odporúčajú niektoré univerzity z bezpečnostných opatrení – môžu tiež zabrániť kontaminácii počas plnenia alebo skladovania v tekutom dusíku.
• Zabráňte úniku- Použite dvojinjektované tesnenia zalisované do skrutkovacieho uzáveru alebo O-krúžkov, aby ste zabránili úniku a kontaminácii.
• Používajte 2D čiarové kódy a ampulky so štítkami– na zabezpečenie sledovateľnosti liekovky s veľkými plochami na písanie umožňujú, aby každá liekovka bola primerane označená. 2D čiarové kódy môžu pomôcť pri správe skladu a vedení záznamov. Farebne označené čiapky sú užitočné pre ľahšiu identifikáciu.
• Primeraná údržba skladu- Aby sa zabránilo strate buniek, skladovacie nádoby by mali neustále monitorovať teplotu a hladiny tekutého dusíka. Mali by byť nainštalované alarmy, ktoré upozornia používateľov na chyby.

Bezpečnostné opatrenia

Kvapalný dusík sa stal bežnou praxou v modernom výskume, ale pri nesprávnom použití so sebou nesie riziko vážneho zranenia.

Pri manipulácii s tekutým dusíkom by sa mali používať vhodné osobné ochranné prostriedky (OOP), aby sa minimalizovalo riziko omrzlín, popálenín a iných nežiaducich udalostí. Opotrebenie

• Kryogénne rukavice
• Laboratórny plášť
• Celotvárový štít odolný voči nárazom, ktorý pokrýva aj krk
• Topánky s uzavretou špičkou
• Plastová zástera odolná voči striekajúcej vode

Chladničky s tekutým dusíkom by mali byť umiestnené v dobre vetraných priestoroch, aby sa minimalizovalo riziko udusenia – uniknutý dusík sa vyparuje a vytláča vzdušný kyslík. Veľkoobjemové sklady by mali mať poplašné systémy s nízkym obsahom kyslíka.

Práca vo dvojici pri manipulácii s tekutým dusíkom je ideálna a jeho používanie mimo bežného pracovného času by malo byť zakázané.

Kryvialky na podporu vášho pracovného postupu

Spoločnosť Suzhou Ace Biomedical ponúka široký výber produktov, ktoré spĺňajú vaše potreby kryokonzervácie pre rôzne typy buniek. Portfólio zahŕňa rad skúmaviek, ako aj rad sterilných kryoskúmaviek.

Naše kryoskúmavky sú:

• Laboratórne skrutkovacie viečko 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Kryoviálne kryogénne liekovky Kryotrubička s kónickým dnom a tesnením

  ● Špecifikácia 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, so sukňou alebo bez sukne
  ● K dispozícii je kónický alebo samostatne stojaci dizajn, sterilný alebo nesterilný
  ● Rúry so skrutkovacím uzáverom sú vyrobené z polypropylénu lekárskej kvality
  ● Liekovky s PP Cryotube je možné opakovane zmraziť a rozmraziť
  ●Konštrukcia vonkajšieho uzáveru môže znížiť pravdepodobnosť kontaminácie počas spracovania vzorky.
  ● Kryogénne skúmavky so skrutkovacím uzáverom Univerzálne skrutkovacie závity na použitie
  ● Rúry sú vhodné pre väčšinu bežných rotorov
  ● O-krúžkové trubice pre kryogénne trubice sú vhodné pre štandardné 1-palcové a 2-palcové, 48-jamkové, 81-jamkové, 96-jamkové a 100-jamkové mraziace boxy
  ● Autoklávovateľné do 121°C a mraziteľné na -86°C

  ČASŤ Č	MATERIÁL	VOLUME	CAPFARBA	PCS/TAŠKA	TAŠKY/Púzdro
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10