Štandardizácia procesov zahŕňa ich optimalizáciu a následné zariadenie a harmonizáciu, čo umožňuje dlhodobý optimálny výkon-nezávisle od používateľa. Štandardizácia zabezpečuje vysokokvalitné výsledky, ako aj ich reprodukovateľnosť a porovnateľnosť.
Cieľom (klasického) PCR je generácia spoľahlivého a reprodukovateľného výsledku. Pre určité aplikácie výnosProdukt PCRje tiež relevantný. Pri týchto reakciách je potrebné venovať starostlivosť, aby sa zabezpečilo, že vzorky nie sú ohrozené a že pracovný tok PCR zostáva stabilný. Konkrétne sa to týka minimalizácie zavedenia kontaminácií, ktoré by mohli viesť k falošne pozitívnym alebo falošne negatívnym výsledkom alebo dokonca inhibovať reakciu PCR. Ďalej by reakčné podmienky mali byť čo najjednoduchšie pre každú jednotlivú vzorku v rámci behu a mali by byť prenosné na následné reakcie (rovnakej metódy). To sa týka zloženia reakcií, ako aj typu regulácie teploty v cykle. Chybám používateľom sa samozrejme treba vyhnúť čo najviac.
Ďalej demonštrujeme výzvy, s ktorými sa vyskytujú počas prípravy a počas celého behu PCR - a prístupy k riešeniam, ktoré existujú s ohľadom na nástroje a spotrebné materiály používané na štandardizáciu pracovných tok PCR.
Príprava reakcie
Dávkovanie reakčných zložiek na PCR-cieva alebo dosky zahŕňa viaceré výzvy, ktoré je potrebné prekonať:
Reakčné podmienky
Presné a presné dávkovanie jednotlivých komponentov je nevyhnutné, keď sa zameriava na čo najjednoduchšie možné reakčné podmienky. Okrem dobrej techniky pipetovania je rozhodujúci výber správneho nástroja. PCR hlavné mixy často obsahujú látky, ktoré zvyšujú viskozitu alebo vytvárajú penu. Počas procesu pipetovania vedú k podstatnému zmáčaniutipy na pipetu, teda zníženie presnosti pipetovania. Použitie priamych dispenzačných systémov alebo alternatívnych špičiek pipety, ktoré sú menej náchylné na zmáčanie, môže zlepšiť presnosť a presnosť procesu pipetovania.
Kontaminácia
Počas procesu dávkovania sa generujú aerosóly, ktoré, ak sa nechajú dosiahnuť vnútornú stranu pipety, môžu potenciálne kontaminovať ďalšiu vzorku počas nasledujúceho kroku pipetovania. Tomu sa dá zabrániť použitím tipov na filtra alebo priamych systémov posunu.
Spotrebný materiál akotipy, cievy a platne, ktoré sa používajú v pracovnom toku PCR, nesmú obsahovať látky, ktoré ohrozujú vzorku alebo falšujú výsledok. Patria sem DNA, Dnázy, RNázy a inhibítory PCR, ako aj komponenty, ktoré môžu potenciálne vylúhovať z materiálu počas reakcie - látky známe ako vylúhovateľné látky.
Chyba používateľa
Čím viac vzoriek sa spracuje, tým vyššie je riziko chybovosti. Môže sa ľahko stať, že vzorka sa pije do nesprávnej nádoby alebo do nesprávnej studne. Toto riziko sa dá výrazne znížiť ľahko rozoznateľným označením studní. Prostredníctvom automatizácie krokov vydávania sa minimalizuje „ľudský faktor“, tj chyby a variácie súvisiace s používateľom, čím sa zvyšuje reprodukovateľnosť, najmä v prípade objemov malých reakcií. Vyžaduje si to, aby sa na pracovnej stanici využili dosky dostatočnej rozmerovej stability. Pripojené čiarové kódy poskytujú ďalšiu čitateľnosť stroja, čo zjednodušuje sledovanie vzoriek počas celého procesu.
Programovanie termokyklu
Programovanie prístroja sa môže ukázať ako časovo náročné a náchylné na chyby. Rôzne funkcie tepelného cyklu PCR spolupracujú na zjednodušení tohto kroku procesu a čo je najdôležitejšie, aby bol v bezpečí:
Ľahká prevádzka a dobré usmernenie používateľa sú základom efektívneho programovania. Na základe tejto nadácie bude správa používateľov chránená heslom zabrániť zmenám vlastných programov ostatných používateľov. Ak sa používa viac cyklistov (toho istého typu), je prospešné, ak sa program môže preniesť priamo z jedného nástroja do druhého prostredníctvom USB alebo pripojenia. Počítačový softvér umožňuje centrálnu a bezpečnú správu programov, práv používateľov a dokumentov v počítači.
PCR beh
Počas behu je DNA amplifikovaná v reakčnej nádobe, kde by sa každá vzorka mala podrobiť rovnakým, konzistentným reakčným podmienkam. Pre tento proces sú relevantné nasledujúce aspekty:
Regulácia teploty
Vynikajúca presnosť regulácie teploty a homogenity bloku cyklu je základom rovnomerného kondicionovania všetkých vzoriek. Vysoká kvalita vykurovacích a chladiacich prvkov (Peltier Elements), ako aj spôsob, akým sú pripojené k bloku, sú rozhodujúce faktory, ktoré určujú riziko nezrovnalostí teploty známych ako „okrajový efekt“
Odparovanie
Koncentrácie jednotlivých reakčných zložiek by sa nemali meniť v priebehu reakcie v dôsledku odparovania. Inak je možné, že veľmi máloProdukt PCRMôže sa generovať alebo vôbec žiadne. Preto je nevyhnutné minimalizovať odparovanie zabezpečením bezpečného tesnenia. V tomto prípade vyhrievané veko termokykleru a tesnenie nádoby v ruke. K dispozícii sú rôzne možnosti tesnenia preDosky PCR (odkaz: tesnenie), pričom najlepšie tesnenie sa dosiahne tepelným utesnením. Vhodné môžu byť aj ďalšie uzávery, pokiaľ je možné nastaviť kontaktný tlak veka cyklera na vybrané tesnenie.
Zavedená sa štandardizácia procesu s cieľom chrániť presné a reprodukovateľné výsledky z dlhodobého hľadiska. To zahŕňa pravidelnú údržbu zariadenia, aby sa zabezpečilo, že je vždy v dobrom pracovnom stave. Všetky spotrebné materiály by mali byť neustále vysokej kvality vo všetkých vyrábaných pozemkoch a ich spoľahlivé dostupnosť musí byť zaručená.
Čas príspevku: november-29-2022