Štandardizácia procesov zahŕňa ich optimalizáciu a následné nastavenie a harmonizáciu, umožňujúcu dlhodobo optimálny výkon – nezávislý od používateľa. Štandardizácia zabezpečuje vysokokvalitné výsledky, ako aj ich reprodukovateľnosť a porovnateľnosť.
Cieľom (klasickej) PCR je vytvorenie spoľahlivého a reprodukovateľného výsledku. Pri určitých aplikáciách je výťažokPCR produktje tiež relevantné. Pri týchto reakciách je potrebné dbať na to, aby vzorky neboli ohrozené a aby pracovný postup PCR zostal stabilný. Konkrétne to znamená minimalizáciu vnášania kontaminácií, ktoré by mohli viesť k falošne pozitívnym alebo falošne negatívnym výsledkom alebo dokonca inhibovať reakciu PCR. Okrem toho by reakčné podmienky mali byť čo najviac identické pre každú jednotlivú vzorku v rámci cyklu a mali by byť tiež prenosné na následné reakcie (rovnakou metódou). To sa týka zloženia reakcií, ako aj typu regulácie teploty v cyklovači. Samozrejme, je potrebné sa čo najviac vyhnúť chybám používateľov.
Nižšie ukážeme výzvy, ktoré sa vyskytujú počas prípravy a priebehu PCR – a prístupy k riešeniam, ktoré existujú v súvislosti s nástrojmi a spotrebným materiálom používaným na štandardizáciu pracovných postupov PCR.
Príprava reakcie
Dávkovanie reakčných zložiek do PCR nádob alebo platní zahŕňa viacero problémov, ktoré je potrebné prekonať:
Reakčné podmienky
Presné a presné dávkovanie jednotlivých zložiek je nevyhnutné pri snahe o čo najidentickejšie reakčné podmienky. Okrem dobrej techniky pipetovania je rozhodujúci výber správneho nástroja. PCR master-mixy často obsahujú látky, ktoré zvyšujú viskozitu alebo vytvárajú penu. Počas procesu pipetovania vedú k podstatnému zmáčaniušpičky pipiet, čím sa zníži presnosť pipetovania. Použitie systémov priameho dávkovania alebo alternatívnych pipetových špičiek, ktoré sú menej náchylné na zmáčanie, môže zlepšiť presnosť a presnosť procesu pipetovania.
Kontaminácie
Počas procesu dávkovania sa vytvárajú aerosóly, ktoré, ak sa dostanú do vnútra pipety, môžu potenciálne kontaminovať ďalšiu vzorku počas nasledujúceho pipetovacieho kroku. Tomu sa dá predísť použitím filtračných koncoviek alebo systémov priameho vytesňovania.
Spotrebný materiál ako naprtipy, nádoby a platne, ktoré sa používajú v pracovnom postupe PCR, nesmú obsahovať látky, ktoré ohrozujú vzorku alebo falšujú výsledok. Patria sem DNA, DNázy, RNázy a inhibítory PCR, ako aj zložky, ktoré sa môžu potenciálne vylúhovať z materiálu počas reakcie – látky známe ako vylúhovateľné látky.
Chyba používateľa
Čím viac vzoriek sa spracuje, tým vyššie je riziko chyby. Ľahko sa môže stať, že sa vzorka napipetuje do nesprávnej nádoby alebo do nesprávnej jamky. Toto riziko sa dá výrazne znížiť ľahko rozpoznateľným označením jamiek. Automatizáciou dávkovacích krokov sa minimalizuje „ľudský faktor“, tj chyby a variácie súvisiace s používateľom, čím sa zvyšuje reprodukovateľnosť, najmä v prípade malých reakčných objemov. To si vyžaduje, aby sa v pracovnej stanici použili dosky dostatočnej rozmerovej stability. Pripojené čiarové kódy poskytujú dodatočnú strojovú čitateľnosť, čo zjednodušuje sledovanie vzorky počas celého procesu.
Programovanie termocykléra
Programovanie nástroja sa môže ukázať ako časovo náročné a tiež náchylné na chyby. Rôzne funkcie tepelného cykléra PCR spolupracujú na zjednodušení tohto kroku procesu a čo je najdôležitejšie, aby bol bezpečný:
Jednoduchá obsluha a dobré vedenie používateľa sú základom efektívneho programovania. Na tomto základe bude administrácia používateľov chránená heslom zabrániť tomu, aby boli vlastné programy zmenené inými používateľmi. Ak sa používa viacero cyklovačov (rovnakého typu), je výhodné, ak je možné program prenášať priamo z jedného nástroja do druhého cez USB alebo konektivitu. Počítačový softvér umožňuje centrálnu a bezpečnú správu programov, užívateľských práv a dokumentov na počítači.
beh PCR
Počas cyklu sa DNA amplifikuje v reakčnej nádobe, kde by sa každá vzorka mala podrobiť rovnakým, konzistentným reakčným podmienkam. Pre proces sú dôležité tieto aspekty:
Regulácia teploty
Vynikajúca presnosť regulácie teploty a homogenita bloku cyklovača sú základom pre rovnomernú úpravu teploty všetkých vzoriek. Vysoká kvalita vykurovacích a chladiacich prvkov (peltierových prvkov), ako aj spôsob, akým sú pripojené k bloku, sú rozhodujúce faktory, ktoré určia riziko teplotných rozdielov známych ako „edge effect“
Odparovanie
Koncentrácie jednotlivých reakčných zložiek by sa nemali v priebehu reakcie meniť v dôsledku vyparovania. Inak je možné, že veľmi máloPCR produktmôže byť vygenerovaná alebo žiadna. Preto je nevyhnutné minimalizovať odparovanie zabezpečením bezpečného utesnenia. V tomto prípade vyhrievané veko termocykléra a tesnenie nádoby pracujú ruka v ruke. K dispozícii sú rôzne možnosti tesneniaPCR platne (odkaz: Tesniaci článok), pričom najlepšie utesnenie sa dosiahne tepelným utesnením. Vhodné môžu byť aj iné uzávery, pokiaľ možno prítlak veka cyklovača prispôsobiť zvolenému tesneniu.
Procesná štandardizácia je zavedená s cieľom zabezpečiť presné a reprodukovateľné výsledky z dlhodobého hľadiska. To zahŕňa pravidelnú údržbu zariadenia, aby sa zabezpečilo, že bude vždy v dobrom prevádzkovom stave. Všetok spotrebný materiál by mal mať konzistentne vysokú kvalitu vo všetkých vyrábaných sériách a musí byť zaručená jeho spoľahlivá dostupnosť.
Čas odoslania: 29. novembra 2022