Zavedenie
Čo je extrakcia nukleových kyselín?
V najjednoduchších pojmoch je extrakcia nukleových kyselín odstránením RNA a/alebo DNA zo vzorky a všetok prebytok, ktorý nie je potrebný. Proces extrakcie izoluje nukleové kyseliny zo vzorky a poskytuje ich vo forme koncentrovaného eluátu bez riedidiel a kontaminantov, ktoré by mohli ovplyvniť akékoľvek downstream aplikácie.
Aplikácie extrakcie nukleových kyselín
Purifikované nukleové kyseliny sa používajú v množstve rôznych aplikácií, ktoré sa pohybujú vo viacerých rôznych odvetviach. Zdravotná starostlivosť je pravdepodobne oblasť, v ktorej sa používa najviac, s čistenou RNA a DNA potrebnou pre množstvo rôznych z rôznych testovacích účelov.
Aplikácie extrakcie nukleových kyselín v zdravotníctve zahŕňajú:
- sekvenovanie novej generácie (NGS)
- Genotypovanie SNP založené na zosilnení
- Genotypovanie založené na poli
- Trávenie reštrikčných enzýmov
- Analýzy s použitím modifikácie enzýmov (napr. Ligácia a klonovanie)
Existujú aj ďalšie oblasti mimo zdravotnej starostlivosti, kde sa používa extrakcia nukleových kyselín, vrátane, ale nielen na testovanie otcovstva, forenznú a genomiku.
Stručná anamnéza extrakcie nukleových kyselín
Extrakcia DNAdataje dlhú cestu, pričom v roku 1869 bola Miescher vykonaná švajčiarskym lekárom menom Friedrich Miescher. Po zlyhaní s lymfocytmi bol schopný získať surovú zrazeninu DNA z leukocytov nájdených v hnise na vyradených obväzoch. Urobil to pridaním kyseliny a potom alkali do bunky, aby opustil cytoplazmu bunky, a potom vyvinul protokol na oddelenie DNA od ostatných proteínov.
Po Miescherovom priekopníckom výskume mnohí ďalší vedci pokračovali v pokroku a vývoja techník na izoláciu a čistenie DNA. Edwin Joseph Cohn, vedec proteínu, vyvinul počas druhej svetovej vojny veľa techník na čistenie proteínov. Bol zodpovedný za izoláciu frakcie krvnej plazmy v sére, ktorá je dôležitá pri udržiavaní osmotického tlaku v krvných cievach. To bolo rozhodujúce pre udržanie nažive vojakov.
V roku 1953 Francis Crick, spolu s Rosalind Franklin a James Watson, určili štruktúru DNA, čo ukazuje, že bola tvorená dvoma vláknami dlhých reťazcov nukleotidov nukleových kyselín. Tento prielomový objav vydláždil cestu pre Meselsona a Stahl, ktorí boli schopní vyvinúť protokol centrifugácie hustoty gradientu, aby izoloval DNA od baktérií E. coli, keď demonštrovali polokonzervatívnu replikáciu DNA počas svojho experimentu z roku 1958.
Techniky extrakcie nukleových kyselín
Aké sú 4 štádiá extrakcie DNA?
Všetky metódy extrakcie sa znižujú na rovnaké základné kroky.
Narušenie buniek. Táto fáza, známa tiež ako bunková lýza, zahŕňa rozdelenie bunkovej steny a/alebo bunkovej membrány, aby sa uvoľnili intra-celulárne tekutiny obsahujúce záujmové nukleové kyseliny.
Odstránenie nežiaducich zvyškov. Zahŕňa to membránové lipidy, proteíny a iné nežiaduce nukleové kyseliny, ktoré môžu interferovať s aplikáciami do následných prúdov.
Izolácia. Existuje niekoľko rôznych spôsobov, ako izolovať nukleové kyseliny, ktoré sú predmetom záujmu z vyčisteného lyzátu, ktorý ste vytvorili, ktoré spadajú medzi dve hlavné kategórie: založené na roztoku alebo v tuhom stave (pozri nasledujúcu časť).
Koncentrácia. Po izolovaných nukleových kyselinách od všetkých ostatných kontaminantov a riedidla sú prezentované vo vysoko koncentrovanej eluácii.
Dva typy extrakcie
Existujú dva typy extrakcie nukleových kyselín - metódy založené na roztokoch a metódy tuhého stavu. Metóda založená na roztoku je tiež známa ako metóda chemickej extrakcie, pretože zahŕňa použitie chemikálií na rozloženie bunky a prístup k nukleovému materiálu. Môže to používať buď organické zlúčeniny, ako je fenol a chloroform, alebo menej škodlivé, a preto odporúčané anorganické zlúčeniny, ako je proteináza K alebo silikagél.
Príklady rôznych metód chemickej extrakcie na rozdelenie bunky zahŕňajú:
- osmotické prasknutie membrány
- Enzymatické trávenie bunkovej steny
- Solubilizácia membrány
- s detergentmi
- s alkalickou liečbou
Techniky tuhého stavu, známe tiež ako mechanické metódy, zahŕňajú využitie toho, ako DNA interaguje s pevným substrátom. Výberom guľôčky alebo molekuly, na ktorú sa DNA viaže, ale analyt nebude, je možné ich oddeliť. Príklady techník extrakcie tuhej fázy vrátane použitia oxidu kremičitého a magnetických guľôčok.
Vysvetlila sa extrakcia magnetických guľôčok
Metóda extrakcie magnetických guľôčok
Potenciál extrakcie pomocou magnetických guľôčok bol prvýkrát uznaný v americkom patente, ktorý podal Trevor Hawkins, pre výskumnú inštitúciu Whitehead Institute. Tento patent uznal, že je možné extrahovať genetický materiál ich viazaním na nosič s pevným nosičom, ktorý by mohol byť magnetickým guľôčkom. Princíp je, že používate vysoko funkcionalizovanú magnetickú guľôčku, na ktorú sa bude genetický materiál viazať, ktorý sa potom môže oddeliť od supernatantu nanesením magnetickej sily na vonkajšiu stranu nádoby, ktorá drží vzorku.
Prečo používať extrakciu magnetických guľôčok?
Technológia extrakcie magnetických guľôčok sa stáva čoraz častejšou, a to z dôvodu potenciálu, ktorý drží pre rýchle a efektívne extrakčné postupy. V nedávnej dobe sa objavili vysoko funkcionalizované magnetické guľôčky s vhodnými tlmivými systémami, ktoré umožnili automatizáciu extrakcie nukleových kyselín a pracovného postupu, ktorý je veľmi ľahký a nákladovo efektívny. Metódy extrakcie magnetických guľôčok tiež nezahŕňajú odstredivé kroky, ktoré môžu spôsobiť šmykové sily, ktoré rozdeľujú dlhšie kúsky DNA. To znamená, že dlhšie pramene DNA zostávajú neporušené, čo je dôležité pri testovaní genomiky.
Čas príspevku: november-25-2022