මගේ PCR ප්‍රතික්‍රියාවට අපි කොපමණ අච්චු එකතු කළ යුතුද?

න්‍යායාත්මකව, සැකිල්ලේ එක් අණුවක් ප්‍රමාණවත් වුවද, සාමාන්‍යයෙන් සම්භාව්‍ය PCR සඳහා සැලකිය යුතු විශාල DNA ප්‍රමාණයක් භාවිතා වේ, උදාහරණයක් ලෙස, ප්‍රවේණික ක්ෂීරපායී DNA 1 µg දක්වා සහ ප්ලාස්මිඩ් DNA වල 1 pg තරම් කුඩා ප්‍රමාණයක්. ප්රශස්ත ප්රමාණය බොහෝ දුරට ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි පිටපත් සංඛ්යාව මත මෙන්ම එහි සංකීර්ණත්වය මත රඳා පවතී.

ඉතා කුඩා අච්චුවක් භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රමාණවත් නිෂ්පාදන ප්‍රමාණයක් ලබා ගැනීම සඳහා විස්තාරණ චක්‍ර ගණනෙහි අනුරූප වැඩි වීමක් අවශ්‍ය වේ. බොහෝ PCR අත්හදා බැලීම් සඳහා භාවිතා කරන Taq පොලිමරේස් නිවැරදි කිරීමේ ශ්‍රිතයක් (3′-5′ exonuclease ක්‍රියාකාරකම්) ඇතුළත් නොවේ; මේ අනුව, විස්තාරණය කිරීමේදී සිදුවන දෝෂ නිවැරදි කළ නොහැක. චක්‍ර ගණන වැඩි වන තරමට දෝෂ සහිත නිෂ්පාදනයේ විස්තාරණය වඩාත් ප්‍රචලිත වේ. අනෙක් අතට, අච්චුවේ ප්‍රමාණය ඉතා වැඩි නම්, ප්‍රයිමර් අනෙකුත් (සියයට සියයක් අනුපූරක නොවන) අනුපිළිවෙලට ප්‍රාථමික වීමේ සම්භාවිතාව මෙන්ම ප්‍රයිමර් ඩිමර් සෑදීමේ සම්භාවිතාව වැඩි වන අතර එමඟින් විස්තාරණය වේ. අතුරු නිෂ්පාදන. බොහෝ අවස්ථාවන්හිදී, DNA සෛල සංස්කෘතීන්ගෙන් හෝ ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ගෙන් හුදකලා වන අතර පසුව PCR අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරයි. පිරිසිදු කිරීමෙන් පසුව, PCR සැකසුම සඳහා අවශ්‍ය පරිමාව නිර්වචනය කිරීමට හැකි වන පරිදි DNA සාන්ද්‍රණය තීරණය කිරීම අවශ්‍ය වේ. ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය ඇස්තමේන්තුවක් සැපයීමට සේවය කළ හැකි නමුත්, මෙම ක්‍රමය නිවැරදි නොවේ. UV-Vis වර්ණාවලීක්ෂ ප්‍රකාශමිතිය න්‍යෂ්ටික අම්ල ප්‍රමාණ කිරීම සඳහා රන් ප්‍රමිතිය ලෙස ස්ථාපිත කර ඇත; මෙම සෘජු හා ඒ නිසා පහසු සහ ඉක්මන් ක්‍රමය මඟින් නියැදියේ අවශෝෂණය 260 nm දී මනිනු ලබන අතර සාන්ද්‍රණය ගණනය කරනු ලබන්නේ පරිවර්තන සාධකයක් ආධාරයෙන් ය.

DNA සාන්ද්‍රණය ඉතා අඩු නම්, කෙසේ වෙතත් (< 1 µg/mL dsDNA), හෝ එය 260 nm පරාසය තුළ අවශෝෂණය කරන ද්‍රව්‍ය වලින් දූෂිත නම් (උදා: RNA, ප්‍රෝටීන්, ලවණ), මෙම ක්‍රමය එහි සීමාවන් කරා ළඟා වේ. ඉතා අඩු සාන්ද්‍රණයන්හිදී, කියවීම් ඉතා ඉක්මනින් භාවිතයට ගැනීමට නොහැකි තරම් සාවද්‍ය බවට පත් වනු ඇති අතර, දූෂණය (සමහර විට අති විශාල) සත්‍ය අගය අධිතක්සේරු කිරීමට තුඩු දෙනු ඇත. මෙම අවස්ථාවෙහිදී, ප්‍රතිදීප්තතාව භාවිතයෙන් ප්‍රමාණ කිරීම විකල්පයක් ඉදිරිපත් කළ හැකිය. මෙම තාක්ෂණය පදනම් වී ඇත්තේ නියුක්ලෙයික් අම්ලය සහ ඩයි වලින් සමන්විත සංකීර්ණය පමණක් dsDNA සමඟ බන්ධනය වන ප්‍රතිදීප්ත සායම් භාවිතය මත වන අතර එය පසුව තරමක් වැඩි තරංග ආයාමයකින් යුත් ආලෝකයක් නිකුත් කරයි. මෙහිදී, ප්‍රතිදීප්ත සංඥාවේ තීව්‍රතාවය DNA ප්‍රමාණයට සමානුපාතික වන අතර, සාන්ද්‍රණය තීරණය කිරීම සඳහා එය සම්මත වක්‍රයකට අදාළව ඇගයීමට ලක් කෙරේ. මෙම ක්‍රමයේ වාසි රඳා පවතින්නේ බන්ධනයේ විශේෂත්වය මත වන අතර එය දූෂණය මගින් හඳුන්වා දෙන බාහිර බලපෑම් බැහැර කරයි, මෙන්ම DNA වල ඉතා අඩු සාන්ද්‍රණයන් හඳුනා ගැනීමේ හැකියාව මත වේ. ඕනෑම ක්‍රමයක යෝග්‍යතාවය ප්‍රධාන වශයෙන් නියැදි සාන්ද්‍රණය සහ සංශුද්ධතාවය මත රඳා පවතී; බොහෝ අවස්ථාවල දී ක්රම දෙකම සමාන්තරව යෙදීම පවා යෝග්ය විය හැකිය.