اسان کي منهنجي پي سي آر جي رد عمل ۾ ڪيترو ٽيمپليٽ شامل ڪرڻ گهرجي؟

جيتوڻيڪ نظريي ۾، ٽيمپليٽ جو هڪ ماليڪيول ڪافي هوندو، ڊي اين اي جي وڏي مقدار کي عام طور تي هڪ کلاسک پي سي آر لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي، مثال طور، 1 µg تائين جينوميڪ ميمالين ڊي اين اي ۽ جيترو ٿورڙو 1 pg پلاسميڊ ڊي اين اي. وڌ ۾ وڌ رقم جو دارومدار حدف جي ترتيب جي نقلن جي تعداد تي، گڏوگڏ ان جي پيچيدگي تي.

جيڪڏهن تمام ٿوري ٽيمپليٽ استعمال ٿئي ٿي، پيداوار جي ڪافي مقدار حاصل ڪرڻ لاء ايمپليفڪيشن چڪر جي تعداد ۾ ساڳئي واڌ جي ضرورت پوندي. هڪ Taq پوليميرس جيڪو اڪثر PCR تجربن لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ان ۾ اصلاحي فعل (3′-5′ exonuclease activity) نه هوندو آهي؛ اهڙيء طرح، amplification دوران پيدا ٿيندڙ غلطيون درست نه ٿي ڪري سگھجي. سائيڪلن جو تعداد جيترو وڌيڪ هوندو، اوترو ئي غلط پراڊڪٽ جي واڌ ويجهه ٿيندي. جيڪڏهن، ٻئي طرف، ٽيمپليٽ جي مقدار تمام گهڻي آهي، پرائمر جو امڪان ٻين (نه هڪ سئو سيڪڙو تعظيم واري) ترتيبن سان اينيلنگ، ۽ گڏوگڏ پرائمر ڊائمرز جي ٺهڻ جو امڪان، وڌندو، جنهن جي نتيجي ۾ واڌارو ٿيندو. ضمني پراڊڪٽس. ڪيترين ئي صورتن ۾، ڊي اين اي سيل ڪلچرن يا مائڪروجنزمن کان ڌار ڪيو ويندو آهي ۽ بعد ۾ پي سي آر ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويندو آهي. صاف ڪرڻ کان پوء، اهو ضروري آهي ته ڊي اين اي جي ڪنسنٽريشن کي طئي ڪرڻ جي قابل ٿي مقدار کي بيان ڪرڻ جي قابل آهي جيڪو پي سي آر سيٽ اپ لاء گهربل آهي. جڏهن ته agarose gel electrophoresis هڪ تخمينو مهيا ڪرڻ جي خدمت ڪري سگهي ٿو، اهو طريقو صحيح کان پري آهي. UV-Vis spectrophotometry قائم ڪئي وئي آهي سون جي معيار جي طور تي نيوڪليڪ اسيد جي مقدار لاءِ؛ هي سڌو ۽ آسان ۽ تڪڙو طريقو نموني جي جذب کي 260 nm تي ماپ ڪري ٿو، ۽ ڪنسنٽريشن کي ڪنورشن فيڪٽر جي مدد سان ڳڻيو ويندو آهي.

جيڪڏهن ڊي اين اي ڪنسنٽريشن تمام گهٽ آهي، تنهن هوندي به (<1 µg/mL dsDNA)، يا جيڪڏهن اهو انهن شين سان آلوده آهي جيڪي پڻ 260 nm جي حد ۾ جذب ​​ڪن ٿا (مثال طور RNA، پروٽين، لوڻ)، اهو طريقو پنهنجي حد تائين پهچي ويندو. تمام گھٽ ڪنسنٽريشن جي صورت ۾، پڙھڻ جلد ئي استعمال ڪرڻ لاءِ بلڪل غلط ٿي ويندا، ۽ آلودگي (ڪڏھن ڪڏھن وڏا) اصل قدر جي حد کان وڌي ويندي. انهي حالت ۾، فلوروسينس استعمال ڪندي مقدار جي لحاظ کان هڪ متبادل پيش ڪري سگھي ٿو. هي ٽيڪنڪ هڪ فلورسنٽ ڊائي جي استعمال تي ٻڌل آهي جيڪا خاص طور تي dsDNA سان جڙيل آهي صرف ڪمپليڪس جنهن ۾ نيوڪليڪ ايسڊ ۽ رنگ شامل آهي روشني سان پرجوش آهي، ۽ اهو بعد ۾ ٿوري گهڻي موج جي روشني کي خارج ڪندو. هتي، فلورسنٽ سگنل جي شدت ڊي اين اي جي مقدار سان متناسب آهي، ۽ ڪنسنٽريشن کي طئي ڪرڻ لاءِ ان کي معياري وکر جي حوالي سان جانچيو ويندو آهي. هن طريقي جا فائدا بانڊ جي خاصيت تي رکيل آهن، جيڪي خارجي اثرات کي خارج ڪن ٿا جيڪي آلودگي جي ذريعي متعارف ڪرايا ويا آهن، ۽ انهي سان گڏ ڊي اين اي جي تمام گهٽ ڪنسنٽريشن کي ڳولڻ جي نتيجي ۾. ڪنهن به طريقي جي مناسبيت جو دارومدار خاص طور تي نموني جي حراست ۽ پاڪائي تي آهي. ڪيترين ئي صورتن ۾ اهو پڻ مشورو ٿي سگهي ٿو ته ٻنهي طريقن کي متوازي ۾ لاڳو ڪرڻ لاء.