Криопробиркиобычно используются для криогенного хранения клеточных линий и других важных биологических материалов в сосудах Дьюара, заполненных жидким азотом.

Успешное сохранение клеток в жидком азоте проходит в несколько этапов. Хотя основным принципом является медленное замораживание, конкретный метод зависит от типа клеток и используемого криопротектора. Существует несколько соображений безопасности и рекомендаций, которые следует учитывать при хранении элементов при таких низких температурах.

Целью этой статьи является дать обзор того, как криопробирки хранятся в жидком азоте.

Что такое криопробирки

Криопробирки — это небольшие флаконы с крышками, предназначенные для хранения жидких проб при чрезвычайно низких температурах. Они гарантируют, что клетки, сохраненные в криопротекторе, не вступают в прямой контакт с жидким азотом, сводя к минимуму риск разрушения клеток, сохраняя при этом экстремальный охлаждающий эффект жидкого азота.

Флаконы обычно доступны в различных объемах и дизайнах: они могут иметь внутреннюю или внешнюю резьбу, плоское или закругленное дно. Также доступны стерильные и нестерильные форматы.

Кто используетКировиалыхранить клетки в жидком азоте

Ряд Национальной службы здравоохранения и частных лабораторий, а также исследовательских институтов, специализирующихся на хранении пуповинной крови, биологии эпителиальных клеток, иммунологии и биологии стволовых клеток, используют криопробирки для криоконсервации клеток.

Клетки, сохраняемые таким способом, включают В- и Т-клетки, клетки СНО, гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, гибридомы, кишечные клетки, макрофаги, мезенхимальные стволовые клетки и клетки-предшественники, моноциты, миелому, NK-клетки и плюрипотентные стволовые клетки.

Обзор того, как хранить криопробирки в жидком азоте

Криоконсервация — это процесс сохранения клеток и других биологических конструкций путем их охлаждения до очень низких температур. Клетки могут храниться в жидком азоте годами без потери жизнеспособности клеток. Это краткое описание применяемых процедур.

Подготовка клеток

Точный метод подготовки образцов будет варьироваться в зависимости от типа клеток, но, как правило, клетки собирают и центрифугируют для получения богатого клетками осадка. Этот осадок затем ресуспендируют в надосадочной жидкости, смешанной с криопротектором или средой для криоконсервации.

Криоконсервационная среда

Эта среда используется для сохранения клеток в низкотемпературной среде, которой они будут подвергаться, путем ингибирования образования внутри- и внеклеточных кристаллов и, следовательно, гибели клеток. Их роль заключается в обеспечении безопасной и защитной среды для клеток и тканей во время процессов замораживания, хранения и оттаивания.

Среду, такую ​​как свежезамороженная плазма (СЗП), раствор гепаринизированного плазмолита или растворы, не содержащие сыворотки и животных компонентов, смешивают с криопротекторами, такими как диметилсульфоксид (ДМСО) или глицерин.

Повторно разжиженный осадок образца разливается в полипропиленовые криопробирки, такие какСучжоуская биомедицинская компания Криогенные флаконы для хранения.

Важно не переполнять криопробирки, поскольку это увеличит риск растрескивания и возможного выброса содержимого (1).

Контролируемая скорость замораживания

Обычно для успешной криоконсервации клеток используется медленная контролируемая скорость замораживания.

После того, как образцы распределены по криогенным флаконам, их помещают на влажный лед или в холодильник с температурой 4℃ и процедуру замораживания начинают в течение 5 минут. Обычно клетки охлаждаются со скоростью от -1 до -3 в минуту (2). Это достигается с помощью программируемого охладителя или путем помещения флаконов в изолированную коробку, помещенную в морозильную камеру с контролируемой скоростью от –70°C до –90°C.

Перевод на жидкий азот

Замороженные криогенные флаконы затем переносят в резервуар с жидким азотом на неопределенный период времени при условии поддержания температуры ниже -135 ℃.

Эти сверхнизкие температуры можно получить путем погружения в жидкую или паровую фазу азота.

Жидкая или паровая фаза?

Известно, что хранение в жидкой фазе азота позволяет поддерживать низкую температуру с абсолютной стабильностью, но часто не рекомендуется по следующим причинам:

• Потребность в больших объемах (глубине) жидкого азота представляет собой потенциальную опасность. Ожоги или удушье из-за этого представляют собой реальный риск.
• Задокументированные случаи перекрестного заражения инфекционными агентами, такими как аспергиллы, вирус гепатита В, и распространение вируса через среду с жидким азотом (2,3)
• Возможность попадания жидкого азота во флаконы во время погружения. При извлечении из хранилища и нагревании до комнатной температуры азот быстро расширяется. Следовательно, флакон может разбиться при извлечении из хранилища жидкого азота, создавая опасность как от летящих обломков, так и от воздействия содержимого (1, 4).

По этим причинам хранение при сверхнизких температурах чаще всего осуществляется в паровой фазе азота. Если образцы необходимо хранить в жидкой фазе, следует использовать специальные криофлексные трубки.

Обратной стороной паровой фазы является то, что может возникнуть вертикальный градиент температуры, приводящий к колебаниям температуры от -135 ℃ до -190 ℃. Это требует тщательного и тщательного мониторинга уровня жидкого азота и изменений температуры (5).

Многие производители рекомендуют хранить криопробирки при температуре до -135 ℃ или использовать только в паровой фазе.

Размораживание криоконсервированных клеток

Процедура оттаивания является стрессовой для замороженной культуры, и для обеспечения оптимальной жизнеспособности, восстановления и функциональности клеток необходимы правильное обращение и техника. Точные протоколы размораживания будут зависеть от конкретных типов клеток. Однако быстрое оттаивание считается стандартным для:

• Уменьшите любое влияние на восстановление клеток.
• Помогите сократить время воздействия растворенных веществ, присутствующих в замораживаемой среде.
• Минимизируйте любые повреждения в результате рекристаллизации льда.

Для оттаивания образцов обычно используются водяные бани, шариковые ванны или специальные автоматизированные инструменты.

Чаще всего одну клеточную линию размораживают в течение 1-2 минут, осторожно перемешивая на водяной бане с температурой 37 ℃ до тех пор, пока во флаконе не останется лишь небольшое количество льда, а затем промывают предварительно нагретой питательной средой.

Для некоторых клеток, таких как эмбрионы млекопитающих, медленное нагревание необходимо для их выживания.

Теперь клетки готовы к клеточной культуре, выделению клеток или, в случае гемопоэтических стволовых клеток, к исследованию жизнеспособности, чтобы гарантировать целостность донорских стволовых клеток перед миелоаблативной терапией.

Обычной практикой является взятие небольших аликвот предварительно промытого образца, используемого для подсчета клеток с целью определения концентрации клеток для посева в культуру. Затем вы можете оценить результаты процедур выделения клеток и определить жизнеспособность клеток.

Лучшие практики хранения криопробирок

Успешная криоконсервация образцов, хранящихся в криопробирках, зависит от многих элементов протокола, включая правильное хранение и ведение учета.

• Разделение ячеек между местами хранения– Если позволяют объемы, разделите ячейки между флаконами и храните их в разных местах, чтобы снизить риск потери образцов из-за сбоев оборудования.
• Предотвратить перекрестное загрязнение– Выбирайте одноразовые стерильные криогенные флаконы или автоклавируйте перед последующим использованием.
• Используйте флаконы подходящего размера для ваших клеток.– Флаконы выпускаются в диапазоне объемов от 1 до 5 мл. Избегайте переполнения флаконов, чтобы снизить риск растрескивания.
• Выберите криогенные флаконы с внутренней или внешней резьбой.– Некоторые университеты рекомендуют флаконы с внутренней резьбой в целях безопасности – они также могут предотвратить загрязнение во время наполнения или при хранении в жидком азоте.
• Предотвратить утечку- Используйте двувпрысковые уплотнения, запрессованные в завинчивающуюся крышку или уплотнительные кольца, чтобы предотвратить утечку и загрязнение.
• Используйте 2D-штрих-коды и маркируйте флаконы.– Для обеспечения возможности отслеживания флаконы с большими полями для надписей позволяют правильно маркировать каждый флакон. 2D-штрих-коды могут помочь в управлении хранилищем и ведении учета. Колпачки с цветовой кодировкой облегчают идентификацию.
• Адекватное обслуживание хранилища- Чтобы гарантировать, что клетки не потеряются, в емкостях для хранения следует постоянно контролировать температуру и уровень жидкого азота. Должна быть установлена ​​сигнализация, предупреждающая пользователей об ошибках.

Меры предосторожности

Жидкий азот стал обычной практикой в ​​современных исследованиях, но при неправильном использовании существует риск серьезной травмы.

Необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы свести к минимуму риск обморожения, ожогов и других неблагоприятных происшествий при работе с жидким азотом. Носить

• Криогенные перчатки
• Лабораторный халат
• Ударопрочный полнолицевой щиток, который также закрывает шею.
• Туфли с закрытым носком
• Брызгозащитный пластиковый фартук

Холодильники с жидким азотом следует размещать в хорошо проветриваемых помещениях, чтобы свести к минимуму риск удушья – вытекший азот испаряется и вытесняет атмосферный кислород. Хранилища больших объемов должны иметь системы сигнализации о низком уровне кислорода.

Работа в парах при работе с жидким азотом идеальна, и его использование вне обычного рабочего времени должно быть запрещено.

Криопробирки для поддержки вашего рабочего процесса

Компания Suzhou Ace Biomedical предлагает широкий выбор продуктов, отвечающих вашим потребностям в криоконсервации различных типов клеток. Ассортимент включает в себя широкий выбор пробирок, а также ряд стерильных криопробирок.

Наши криопробирки:

• Лабораторная винтовая крышка 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл Криовиальные криогенные флаконы Криопробирка с коническим дном и прокладкой

  ● 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, с юбкой или без юбки.
  ● Доступны коническая или отдельностоящая конструкция, стерильная или нестерильная.
  ● Пробирки с завинчивающимися крышками изготовлены из медицинского полипропилена.
  ● ПП-флаконы для криопробирок можно многократно замораживать и оттаивать.
  ●Внешняя конструкция крышки может снизить вероятность загрязнения во время обработки проб.
  ● Криогенные пробирки с винтовой крышкой. Универсальная резьба для использования.
  ● Трубки подходят к большинству распространенных роторов.
  ● Трубки с уплотнительными кольцами для криогенных трубок подходят для стандартных 1-дюймовых и 2-дюймовых, 48-, 81-, 96- и 100-луночных морозильных коробок.
  ● Автоклавируется при температуре 121°C и замораживается до -86°C.

  НОМЕР ЧАСТИ	МАТЕРИАЛ	ОБЪЕМ	КАПЦВЕТ	ПК/СУМКА	СУМКИ/ЧЕХОЛ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10